汪偉偉，張文玲，王曉菲，張晨晰，張立文，田亞平

解放軍總醫(yī)院，北京 100853 1轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；2臨床檢驗(yàn)科

禽類作為重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和理想的生物反應(yīng)器，具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。以禽類模型建立相應(yīng)的細(xì)胞系，可以用于多種病毒的增殖和純化[3]，還可以用來(lái)評(píng)價(jià)環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)的毒性作用[4]。與哺乳動(dòng)物原代細(xì)胞相比，用細(xì)胞系生產(chǎn)制造疫苗具有更突出的優(yōu)勢(shì)[5]。特定的細(xì)胞系用于疫苗生產(chǎn)前，需按規(guī)定對(duì)其進(jìn)行全面鑒定并建立細(xì)胞種子庫(kù)[6]，且傳代細(xì)胞在一定代次后細(xì)胞的致瘤性會(huì)增強(qiáng)[7]。選擇一種永生性細(xì)胞系代替原代細(xì)胞增殖病毒用于疫苗生產(chǎn)非常必要，而細(xì)胞核型反映物種的種質(zhì)特性，是再現(xiàn)性很高的細(xì)胞遺傳學(xué)信息，可以證明傳代細(xì)胞的穩(wěn)定性[8-12]。為了保證細(xì)胞系的純凈和安全性，確保細(xì)胞系有清楚的遺傳背景，對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行染色體核型分析必不可少[5-6]。雞肝癌細(xì)胞系(LMH)最早是由日本于1981年建立，目前常用于疫苗生產(chǎn)制造及藥物篩選體外實(shí)驗(yàn)[13]。Kawaguchi等[14]通過(guò)對(duì)LMH細(xì)胞系第30代和第120代的細(xì)胞核型分析得到該細(xì)胞系的染色體數(shù)目為88 ～ 124條，并且都含有6條標(biāo)記染色體。證明了該細(xì)胞系穩(wěn)定性好，符合生產(chǎn)生物制品對(duì)細(xì)胞核型的要求。但Kawaguchi等制備的染色體短小，分散困難，顯帶后難分辨，且重復(fù)性較差，很難為L(zhǎng)MH細(xì)胞系在生物領(lǐng)域的擴(kuò)展應(yīng)用奠定穩(wěn)定基礎(chǔ)。因此，我們總結(jié)了羊水細(xì)胞、人類淋巴系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞以及雞外周血細(xì)胞的染色體核型制備方法[15-17]，建立了兩種新的LMH細(xì)胞染色體制備方法，并對(duì)這兩種方法進(jìn)行了比較。

材料和方法

1 細(xì)胞及試劑 由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供的24瓶貼壁生長(zhǎng)的雞肝癌細(xì)胞。秋水仙素濃度為250μg/ml；固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)；低滲液：0.6%枸櫞酸鈉；緩沖液：磷酸氫二鉀(1.79 g)和磷酸二氫鈉(0.78 g),加入1 L超純水配制而成；Giemsa染液；0.1%明膠；10%NaHCO3；0.5%的胰酶溶液。

2 分組 將24瓶細(xì)胞系分為兩組，每組12瓶。一組在細(xì)胞傳代前，先用0.1%明膠覆蓋培養(yǎng)瓶底1 h；另一組直接接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中。所有細(xì)胞傳代后均培養(yǎng)72 h。明膠處理后的細(xì)胞采用原位法制備染色體，不作處理一組則采用滴片法制備染色體。

3 原位法制備染色體 向LMH細(xì)胞培養(yǎng)液中加入250μg/ml的秋水仙素150μl，輕輕混勻，放回37℃ CO2恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)60 min。棄去培養(yǎng)液，加入37℃預(yù)溫的0.6%枸櫞酸鈉9 ml；在37℃恒溫環(huán)境中低滲處理40 min。每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入2 ml新配制的固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)，靜置2 min；吸取2 ml懸液后再加入2 ml固定液，靜置2 min；重復(fù)以上步驟3次。棄去瓶中液體，加入9 ml固定液，放入4℃冰箱中低溫固定50 min。棄去瓶中固定液，放入65℃烤箱中老化3 h，自然冷卻待消化。取0.5%胰酶溶液1 ml和10% NaHCO31 ml，加入盛有50 ml 0.9%氯化鈉注射液的染缸中混勻，置37℃預(yù)溫。用吸管吸取5 ml的胰酶混合液迅速加入到培養(yǎng)瓶中，讓混合液均勻鋪在瓶底。消化50 s，倒掉瓶中的消化液，加入Giemsa染液染色18 min。

4 滴片法制備染色體 向LMH細(xì)胞培養(yǎng)液中加入250μg/ml的秋水仙素150μl，輕輕混勻，放回37℃ CO2恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)60 min。棄去培養(yǎng)液，加入37℃預(yù)溫的0.6%枸櫞酸鈉9 ml；在37℃恒溫環(huán)境中低滲處理40 min。輕輕吹打細(xì)胞及瓶壁，將懸液倒入15 ml離心管中，加入1 ml新配制的固定液(甲醇：冰乙酸=3：1)，輕輕吹打混勻，2 000 r/min離心10 min。棄上清，加入5 ml固定液，輕輕吹打混勻后，立即2 000 r/min離心10 min。重復(fù)以上步驟2次，棄上清，加入適量的固定液，制成懸液。吸取少量細(xì)胞懸液，滴3 ～ 4滴于冰水浸泡過(guò)的載玻片上，在酒精燈上來(lái)回過(guò)火數(shù)次，將玻片放入65℃烤箱中烤片3 h，自然冷卻待消化。取0.5%胰酶溶液1 ml和10% NaHCO31 ml，加入盛有50 ml 0.9%氯化鈉注射液的染缸中混勻，置37℃預(yù)溫。將玻片放入胰酶混合液中消化10 s，用0.9%氯化鈉注射液涮洗后，Giemsa染液染色5 min。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間核型數(shù)量及染色體相對(duì)長(zhǎng)度比較采用t檢驗(yàn)，染色體數(shù)目采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 核型數(shù)量比較 在10倍物鏡下對(duì)兩種方法制備的染色體進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)原位法制備的染色體核型數(shù)量明顯多于滴片法。在20倍物鏡下，我們對(duì)兩種方法制備的玻片各選取了10個(gè)視野，將每個(gè)視野中發(fā)現(xiàn)的核型數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示原位法制備的染色體核型數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于滴片法(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1、表1。

2 染色體數(shù)目比較 兩種方法制備的染色體均通過(guò)100倍物鏡進(jìn)行觀察，鏡下可見原位法制備的核型較為緊密，滴片法制備的核型較為分散。從兩種方法制備的核型中各選取50個(gè)條帶良好的核型，記錄每個(gè)核型中染色體條數(shù)，將相同染色體條數(shù)的核型歸為一種類型，統(tǒng)計(jì)不同染色體條數(shù)的出現(xiàn)頻數(shù)。結(jié)果顯示原位法制備的核型類型多于滴片法(P=0.123)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2、圖3、表2。

3 染色體形態(tài)比較 從兩種方法制備的玻片中各選取10組條帶清晰的細(xì)胞核型，根據(jù)染色體的條帶和形態(tài)將染色體分別進(jìn)行排列，觀察比較兩種方法制備的核型，均能發(fā)現(xiàn)6條標(biāo)記染色體，8對(duì)大染色體和一對(duì)性染色體，其余為小染色體及微小染色體。排列好的核型列于圖4中。

4 染色體相對(duì)長(zhǎng)度比較 通過(guò)北昂分析軟件測(cè)量?jī)煞N方法制備的各條大染色體、性染色體和標(biāo)記染色體的相對(duì)長(zhǎng)度，以-x±s表示，兩種方法獲得的同組別染色體相對(duì)長(zhǎng)度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見表3。

表1 兩種方法在20倍物鏡下染色體核型數(shù)目比較Tab. 1 Comparison of karyotype number between two methods under 20 times objective lens

圖 1 10倍物鏡下兩種方法制備的染色體核型數(shù)量比較A：原位法；B：滴片法Fig. 1 Comparison of karyotype number between two methods under 10 times objective lensA: in-situ method; B: dropmethod

圖 3 兩種方法制備的所含不同染色體數(shù)目的核型分布Fig. 3 Comparison of karyotype distribution between two methods

表2 兩種方法制備的不同染色體條數(shù)的核型種類及出現(xiàn)頻數(shù)Tab. 2 Types and occurrence frequency of karyotypes prepared by two methods

表3 兩種方法制備的LMH細(xì)胞染色體相對(duì)長(zhǎng)度比較Tab. 3 Comparison of average chromosome relative length with two methods (-x±s, %)

討 論

染色體核型分析可以用于證明雜交次瘤細(xì)胞是兩親本細(xì)胞產(chǎn)物[18-19]，可以排除細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的污染和細(xì)胞株的錯(cuò)誤鑒別[20-23]。在眾多的細(xì)胞鑒別技術(shù)中，染色體可以通過(guò)倍型、帶型檢查是否有缺失和突變[24-25]。目前有關(guān)雞的染色體制備及核型分析已有較多報(bào)道，但LMH細(xì)胞的染色體制備及核型分析罕見。

LMH細(xì)胞屬于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，Kawaguchi等[14]采用0.2%胰酶將細(xì)胞從瓶壁上消化下來(lái)，但胰酶消化對(duì)溫度、細(xì)胞集落大小、消化時(shí)間長(zhǎng)短都要有所考慮，難以控制把握[15]。我們發(fā)現(xiàn)LMH細(xì)胞貼壁并不牢固，在低滲處理時(shí)細(xì)胞就已經(jīng)從培養(yǎng)瓶上脫落，因此在低滲后只需要將脫落細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中即可，并不需要胰酶處理。原位法為了讓細(xì)胞貼壁牢固，增加細(xì)胞收獲的可靠性，在細(xì)胞培養(yǎng)前就用0.1%明膠鋪于培養(yǎng)瓶底。有文獻(xiàn)指出轉(zhuǎn)移貼壁細(xì)胞時(shí)，容易導(dǎo)致細(xì)胞的丟失、核型減少[26]。兩種制備方法結(jié)果也顯示原位法收獲的核型數(shù)量大于滴片法，且存在顯著差異。

秋水仙素和染色體長(zhǎng)短有密切關(guān)系。秋水仙素加入過(guò)量或處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可導(dǎo)致分裂細(xì)胞多，染色體凝集和收縮變小，或發(fā)生異常分裂現(xiàn)象，甚至染色體破碎，不宜用于染色體形態(tài)觀察及計(jì)數(shù)；秋水仙素加入太少或處理時(shí)間偏短可導(dǎo)致染色體形態(tài)偏長(zhǎng)或無(wú)中期分裂象[27]。我們參考相關(guān)文獻(xiàn)[28-29]，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室對(duì)人類外周血染色體核型的制備經(jīng)驗(yàn)，將兩種方法加入的秋水仙素濃度均定為250μg/ml，加入150μl作用60 min。

低滲處理主要用于誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞膨脹，在后期滴片時(shí)有利于染色體從細(xì)胞中分散出來(lái)。有學(xué)者通過(guò)細(xì)胞膜功能對(duì)低滲液和固定液的作用進(jìn)行了闡述[30]。為保證細(xì)胞不會(huì)因低滲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致染色體分散過(guò)度，甚至細(xì)胞破碎溶解，本實(shí)驗(yàn)的兩種方法均采用0.6%枸櫞酸鈉低滲40 min。

固定液是甲醇與冰醋酸的混合液，目的是維持染色體的形態(tài)。原位法采用2 ml固定液分3次將低滲液置換出來(lái)，然后用9 ml固定液直接作用50 min；滴片法則需要經(jīng)過(guò)3次固定和離心的過(guò)程，較原位法煩瑣。

滴片是滴片法中的一個(gè)很重要環(huán)節(jié)，Spurbeck等[31]首次提出了染色體分散動(dòng)力學(xué)，對(duì)染色體分散過(guò)程做出了詳細(xì)闡述。我們采用冷凍濕片，經(jīng)過(guò)多次嘗試找到最適高度和過(guò)火時(shí)間，使染色體鋪展分散良好，但是這一過(guò)程很難控制，過(guò)于分散的核型不利于染色體計(jì)數(shù)。而原位法則省略了此步，分散更為穩(wěn)定。

兩種方法制備的核型結(jié)果與文獻(xiàn)[14]基本相同，但不完全一致，這是由于微小染色體較多，部分染色體未顯色，并且容易發(fā)生羅伯遜易位，滴片法中微小染色體又極易隨液體漂流造成丟失，此外還容易將部分未溶解的染料顆粒及其他雜質(zhì)誤認(rèn)為是微小染色體[17,32]。

圖 4 兩種方法制備的核型圖比較A:原位法； B：滴片法Fig. 4 Comparison of karyotypes of two methodsA: in-situ method; B: drop method

LMH細(xì)胞系來(lái)源于雞的肝癌細(xì)胞，部分染色體保留了雞類染色體的形態(tài)。不同的文獻(xiàn)對(duì)雞的染色體的描述并不相同。李軍和趙金良[33]認(rèn)為雞的1號(hào)染色體為亞中央著絲粒染色體；部分文獻(xiàn)指出2號(hào)染色體為亞中央著絲粒染色體[34-36]；還有一部分文獻(xiàn)則認(rèn)為7號(hào)染色體為亞中央著絲粒染色體[36-38]；徐琪等[39]則認(rèn)為9號(hào)染色體為亞中央著絲粒染色體。兩種方法制備的LMH細(xì)胞核型中，均可以看見8對(duì)大染色體和一對(duì)性染色體，大染色體中可見4對(duì)亞中央著絲粒染色體，與雞的染色體核型相近，與文獻(xiàn)[14]報(bào)道結(jié)果一致。

筆者通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，證明原位法較滴片法可收獲更多的核型，便于染色體計(jì)數(shù)，提高了分析效率和準(zhǔn)確性，因而優(yōu)于滴片法，值得推廣。

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