★李文生 魏東 譚梅英（1.南海大瀝鹽步社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心 廣東 佛山 5800；.廣東省第二中醫(yī)院 廣州 510095）

自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）為CD3/CD16+56，該細(xì)胞介導(dǎo)對某些腫瘤和病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒作用［1］，是先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素，它通過殺死被病毒感染的細(xì)胞或產(chǎn)生細(xì)胞因子，與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞相互作用來防御病毒感染［2］。NK細(xì)胞占肝臟淋巴細(xì)胞總數(shù)的25%～50%，當(dāng)肝臟受到病毒、酒精、化學(xué)藥物等多種致病因素?fù)p傷時，NK細(xì)胞即被激活并發(fā)揮其免疫活性作用［3］。所以，NK細(xì)胞在防御慢性肝炎病毒感染方面發(fā)揮著重要作用。在我國大約有9300人感染乙肝病毒，通過了解CHB感染過程中免疫細(xì)胞的變化特點，對于提供有效免疫調(diào)節(jié)治療策略具有重要意義。本次研究通過流式細(xì)胞儀檢測外周血中NK細(xì)胞的變化特征，以期分析免疫特征與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase，ALT）、乙型肝炎病毒定量（HBV-DNA）水平的關(guān)系。

1 一般資料

2016年5—2017年11月于南海大瀝鹽步社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心乙肝病患人群進行流行病學(xué)調(diào)查后隨機采樣，共收集了64例乙肝患者，其中男33例，女31例；年齡22～59歲，平均（38.11±10.86）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)為有慢性肝炎的癥狀或體征，血清HBsAg陽性或（和）血清HBVDNA陽性，持續(xù)時間半年以上。排除合并丙肝病毒、丁肝病毒、庚肝病毒、戊肝病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒感染者。符合2015年慢性乙型肝炎防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。按照肝功能情況將CHB患者分為32例肝功能異常組（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶＞2～5ULN）和32例肝功能正常組。另選30例健康體檢者作為對照組，其中男17例，女13例；年齡24～65歲，平均（31.65±8.43）歲。三組在年齡、性別組成方面比較，上無顯著性差別（P＞0.05）。

2 實驗方法

流式細(xì)胞儀：BD FACSCalibur，試劑：白細(xì)胞分化抗原CD3/CD16+56/CD45檢測試劑盒，流式細(xì)胞儀及試劑均為BD公司產(chǎn)品，由廣州金域檢驗中心檢測。

所有患者均在晨起空腹無菌方式靜脈血5mL，采集到無菌的K3 EDTA（乙二胺四乙酸）VACUTAINER采血管中。保存在室溫（20℃～25℃）下的抗凝血，并在抽取后6h內(nèi)染色，染色后6h內(nèi)進行檢測。檢測結(jié)果使用軟件 CellQuest采集并分析。結(jié)果表示為淋巴細(xì)胞群中陽性細(xì)胞百分比。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計量資料采用單因素方差分析，用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，組間比較方差分析，檢驗水準(zhǔn)以P＜0.05判斷差異有無統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 各組間CD3/CD16+56與ALT比較 在肝功能不同階段，肝功能正常組的CD3/CD16+56與對照組間比較，無顯著性差異，而與肝功能異常組比較，組間差異有顯著性，P＜0.05，說明肝功能異常時外周血CD3/CD16+56降低。見表1。

4.2 各組間CD3/CD16+56與HBV-DNA比較 在HBV-DNA相關(guān)性方面，肝功能正常組與肝功能異常組比較，HBV-DNA水平增高，具有顯著性差異，P＜0.05。見表 1。

表1 各組間外周血與ALT、HBV-DNA比較

5 討論

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球公共衛(wèi)生問題，我國有超過9 300萬人感染HBV，HBV病毒感染引起肝損傷主要是由宿主免疫反應(yīng)導(dǎo)致。感染HBV在早期多數(shù)是隱性的，被感染者沒有任何臨床表現(xiàn)，在急性期時，病毒會被先天免疫反應(yīng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)并抑制，隨后出現(xiàn)強效而有力的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，并伴有病毒的清除［5］。而在慢性乙型肝炎患者中，先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)都很弱，因此很少導(dǎo)致病毒清除，而呈現(xiàn)病毒的活躍性。

本研究結(jié)果表明，慢性乙型肝炎（CHB）肝功能正?；颊咄庵苎蠧D3/CD16+56細(xì)胞與肝功能異常組比較，CD3/CD16+56明顯升高，而HBVDNA水平明顯減少，說明當(dāng)肝功能正常時CD3/CD16+56細(xì)胞數(shù)量可能趨向于參與外周血HBVDNA的清除，HBV-DNA水平明顯減少，而肝臟的CD3/CD16+56細(xì)胞數(shù)量趨向減少，從而導(dǎo)致肝臟中病毒可以躲避免疫識別、清除，獲得免疫逃逸能力，導(dǎo)致HBV的持續(xù)感染。

當(dāng)慢性乙型肝炎患者出現(xiàn)肝功能異常時，本研究中肝功能異常組外周CD3/CD16+56細(xì)胞數(shù)量減少，而HBV-DNA水平增高，提示可能是過度活躍的病毒導(dǎo)致CD3/CD16+56細(xì)胞向肝臟內(nèi)遷移，造成外周CD3/CD16+56暫時性的減少，肝臟內(nèi)病毒被抑制清除，發(fā)生炎性及免疫性反應(yīng)，在清除病毒的同時，也會造成肝損傷，故發(fā)生ALT上升。在王陸軍等［6］研究報道中，對于肝功能異常的CHB患者，肝內(nèi)促炎癥亞群CD16+顯著增加，且與ALT呈正相關(guān)，部分證實了CD3/CD16+56細(xì)胞向肝臟內(nèi)遷移的可能，并促進了CHB患者的肝臟內(nèi)炎性損傷，說明CD3/CD16+56的變化參與了病毒的清除過程，這在慢性乙型肝炎的病毒清除機制中可能具有重要意義。另一項縱向研究顯示［7］，CHB患者在使用48周替比夫定抗病毒治療過程中，CD56NK細(xì)胞的數(shù)量和活性功能的恢復(fù)，使部分先天免疫應(yīng)答功能得到增強，這將有助于HBV-DNA病毒的清除，從而實現(xiàn)對CHB患者的長期病毒控制。因此，機體CD3/CD16+56細(xì)胞水平的高低可影響CHB患者HBV的復(fù)制和肝功能損害的程度。

總之，本次通過研究CHB患者兩組不同肝功能水平時外周血CD3/CD16+56變化情況，結(jié)果顯示當(dāng)肝功能異常時，外周血CD3/CD16+56細(xì)胞趨向低水平，患者的免疫狀況逐漸下降，乙肝病毒的活動逐漸增強，說明這可能是導(dǎo)致病毒持續(xù)感染的原因之一，因此，CD3/CD16+56水平對于判斷CHB患者免疫功能及預(yù)后具有非常重要作用，但本研究中關(guān)于肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞變化趨勢及其炎癥因子表達狀況如何，由于未進一步對肝臟病理免疫分析，故無法評價肝臟內(nèi)CD3/CD16+56及HBV-DNA相關(guān)變化。

參考文獻

［1］Fitzgerald-Bocarlsy P, Herberman R, Hercend T, et al.A definition of natural killer cells.Natural Killer Cells and Host Defense [M]. Basel: Karger, 1989:1.

［2］C Colomba, A Cascio, C Caruso, et al. Role of combination NK/KIRs in the natural history of viral infections [J]. Recenti Prog Med, 2017,108(7):333-337.

［3］Sun C, Sun HY, Xiao WH, et al. Natural killer cell dysfunction in hepatocellular carcinoma and NK cell-based immunotherapy [J]. Acta Pharmacol Sin, 2015, 36(10):1 191-1 199.

［4］中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會，中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會.慢性乙型肝炎防治指南（2015版）[J]. 中國肝臟病雜志, 2015, 3(7):1-18.

［5］Tseng TC, Huang LR.Immunopathogenesis of Hepatitis B Virus [J].Journal of Infectious Diseases, 2017, 216(8):765-770.

［6］王陸軍, 呂吉云,張紀(jì)元，等.促炎癥CD16+單核細(xì)胞增加與慢性乙型肝炎患者的肝損傷和纖維化程度關(guān)系[J]. 傳染病信息, 2011,24(4):211-214.

［7］Chen T, Zhu L, Shi A, et al. Functional restoration of CD56(bright)NK cells facilitates immune control via IL-15 and NKG2D in patients under antiviral treatment for chronic hepatitis B [J]. Hepatol Int, 2017,11(5):419-428.