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        穿心蓮內(nèi)酯噴干粉藥代動力學(xué)研究*

        2018-05-11 12:04:40吳雙雙羅曉健何明珍張堯熊靜江西中醫(yī)藥大學(xué)南昌330004江西本草天工科技有限責(zé)任公司南昌330006江中藥業(yè)股份有限公司南昌330096
        江西中醫(yī)藥 2018年5期
        關(guān)鍵詞:血漿

        ★吳雙雙 羅曉健 何明珍 張堯 熊靜(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004;.江西本草天工科技有限責(zé)任公司 南昌 330006;3.江中藥業(yè)股份有限公司 南昌 330096)

        穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide,ADG)是爵床科草本植物穿心蓮主要有效成分,為二萜內(nèi)酯類化合物,具有解熱、消炎、止痛等功效,對細(xì)菌、病毒引起的上呼吸道感染有一定療效,被譽(yù)為“天然抗生素”[1];同時(shí)還能抑制各種惡性腫瘤,包括乳腺、肝、頸、結(jié)腸和胃癌的細(xì)胞系,以及臨床前研究中的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[2-3]。ADG呈無色方形或長方形結(jié)晶;味極苦,在水中幾乎不溶,口服吸收差,生物利用度低[4],限制了其臨床的應(yīng)用。近年來,ADG溶出差、生物利用度低等問題得到眾多藥學(xué)工作者的關(guān)注,如趙國巍等采用溶劑蒸發(fā)法制備了不同藥物-輔料質(zhì)量比的ADG-聚乙二醇固體分散體,能有效提高難溶性藥物ADG的溶出率[5];任科等使用冷凍干燥法制備ADG-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物,使ADG在水中的溶解度可達(dá)到注射劑的要求[6];Hong Du等人以肉豆蔻酸異相丙酯為油相,吐溫80為表面活性劑,醇為助表面活性劑和水制備了ADG微乳制劑,與ADG片劑相比,ADG微乳具有更好的抗炎作用和更高的生物利用度[7]。本實(shí)驗(yàn)前期,將ADG與糊精研磨、混合,采用噴霧干燥技術(shù)制備ADG細(xì)粉,發(fā)現(xiàn)糊精能夠顯著提高ADG溶出度,但還未對ADG噴干粉的體內(nèi)藥代動力學(xué)進(jìn)行探索研究。因此,本實(shí)驗(yàn)建立了LC-MS/MS 方法測定ADG噴干粉給藥后大鼠體內(nèi)血藥濃度,為ADG處方工藝的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器 Nexera X2 LC-30A超高效液相色譜儀,包含在線脫氣機(jī)、高壓二元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱(Shimadzu,日本);QTRAP 4500復(fù)合三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜,配備ESI離子源及Analyst 1.6數(shù)據(jù)處理軟件(AB SCIEX,美國);KQ-4000B型超聲清洗機(jī)(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);旋渦混勻器(杭州奧盛儀器有限公司);MiLLipore-SimpLicity超純水處理系統(tǒng)(默克密理博,德國);AL104分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);CM2000研磨機(jī)(上海依肯機(jī)械設(shè)備有限公司)。

        1.2 試藥 ADG原料(江西青峰醫(yī)藥集團(tuán)有限公司,批號:20160806);ADG對照品(批號110797-201609,中國食品藥品檢定研究院);己烯雌酚(批號100033-201308,中國食品藥品檢定研究院);肝素鈉注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司);乙腈(美國Fisher Scientific,公司色譜純);純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司);甲醇(Anaquur chemicals,色譜純),糊精(張家港浩波化學(xué)品有限公司,藥用級)等。

        1.3 動物 SD大鼠,雄性,SPF級,體重(220±20g)左右,購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司,動物許可證號:SCXK(湘)2016-0002。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 ADG噴干粉的制備

        2.2.1 ADG糊精噴干粉 分別稱取糊精、ADG各50g,混合均勻,投入以200mL純化水為介質(zhì)的膠體磨中,固定研磨機(jī)工藝參數(shù):研磨頻率40Hz,研磨時(shí)間30min。將混合溶液進(jìn)行噴霧干燥,噴霧干燥條件:進(jìn)風(fēng)溫度140℃,空氣壓縮比100%,霧化器壓力柱高40~50,流速8mL/min。噴霧干燥完成后,收集樣品噴干粉,干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.2.2 ADG原料噴干粉 稱取100g 的ADG原料藥適量,按“2.2.1”項(xiàng)固定研磨機(jī)及噴霧干燥工藝參數(shù)。噴霧干燥完成后,收集樣品噴干粉,置干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.2 體內(nèi)分析方法的建立2.2.1 溶液配制 對照品溶液:精密稱取對照品適量,加甲醇溶解稀釋成1mg/mL的儲備液(陰涼保存);臨用前,用甲醇定量稀釋成所需對照品濃度。

        內(nèi)標(biāo)溶液:精密稱取己烯雌酚對照品適量,加甲醇溶解稀釋成250ng/mL的己烯雌酚溶液作為內(nèi)標(biāo)溶液。

        2.2.2 檢測方法的建立 色譜條件:分析柱Waters CORTECS C18柱(4.6mm×100mm,2.7μm);流速0.5mL/min;柱溫40℃;進(jìn)樣量2μL;流動相B相乙腈,A相水;梯度洗脫,結(jié)果見表1。

        質(zhì)譜條件:ESI電噴霧離子源,負(fù)離子檢測;離子源溫度600℃;離子噴霧電壓-4500V;氣簾氣氣壓30psi;霧化氣氣壓50psi;輔助氣氣壓50psi;氣簾氣、霧化氣、輔助氣均為氮?dú)?。掃描模式:多反?yīng)離子監(jiān)測(MRM)。反應(yīng)離子對:ADGm/z 395.0→331.4(去簇電壓DP:-73v;碰撞能量CE:-16ev);己烯雌酚(內(nèi)標(biāo))m/z 267.0→237.0(去簇電壓DP:-99v;碰撞能量CE:-39ev)。

        2.3 血漿樣品處理 取大鼠血漿50μL,置1.5mL具塞尖底離心管中,加入250ng/mL己烯雌酚20μL,再加入80μL甲醇沉淀蛋白,渦旋3min,于15000r/min、5℃下高速離心10min。取上清液進(jìn)樣,進(jìn)樣量為2μL,進(jìn)行分析。

        表1 流動相梯度洗脫程序

        2.4 方法專屬性考察 分別取50μL大鼠空白血漿、空白血漿加入一定濃度的ADG對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液、大鼠給藥后血漿樣品,按“2.3”項(xiàng)下方法操作,將三種樣品進(jìn)行HPLC-MS分析,結(jié)果分別見圖1-3。結(jié)果表明,在選定的色譜及質(zhì)譜檢測條件下,內(nèi)標(biāo)和ADG均可實(shí)現(xiàn)完全分離,血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和代謝物不干擾內(nèi)標(biāo)和ADG的測定。

        圖1 空白血漿樣品

        圖2 空白血漿加ADG和內(nèi)標(biāo)

        圖3 大鼠口服噴干粉后血漿樣品

        2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限 取大鼠空白血漿50μL,置1.5mL 具塞尖底離心管中,加入20μL內(nèi)標(biāo)溶液,再加入適量ADG對照品配制成含ADG血漿質(zhì)量濃度分別為2、5、10、25、50、100、200ng/mL的樣品。按“2.3”項(xiàng)下的方法處理后進(jìn)行HPLC-MS分析。以樣品中ADG的濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo),ADG峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo),采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算,得ADG標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0335X+0.0123(r=0.9985)(n=3),表 明 ADG的質(zhì)量濃度在2~200ng/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

        最低定量限為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度點(diǎn),滿足信噪比S/N大于10,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)及相對誤差(RE)均在標(biāo)示值的15%以內(nèi)。結(jié)果表明本方法在2~200ng/mL范圍內(nèi)線性良好,定量下限為2ng/mL(S/N>10)。

        2.7 提取回收率 取大鼠空白血漿,按“2.5”項(xiàng)下方法,分別制備ADG低、中、高四個(gè)濃度(2、5、100、150ng/mL)的ADG樣品,渦旋離心后,取上清液,進(jìn)樣分析,每種濃度平行6樣本。另取大鼠空白血漿,不加入內(nèi)標(biāo)及待測物標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理,揮干后的殘?jiān)屑尤胛醇踊|(zhì)但加內(nèi)標(biāo)的ADG標(biāo)準(zhǔn)液,使其終濃度分別為2、5、100、150ng/mL,渦旋離心后,取上清液,進(jìn)樣分析,每種濃度平行6樣本分析。以每種濃度的兩種不同處理方法分析得到的峰面積比值計(jì)算提取回收率。結(jié)果見表2,經(jīng)測定,該方法ADG低、中、高四個(gè)濃度的提取回收率分別為89.90%、88.67%、95.37%、98.67%,內(nèi)標(biāo)的提取回收率均值為94.55%,均符合相關(guān)規(guī)定,表明四種濃度樣品提取回收率良好。

        2.6 基質(zhì)效應(yīng) 取空白血漿,按“2.3”方法進(jìn)行處理,揮干后的殘?jiān)?,加入未加基質(zhì)但加內(nèi)標(biāo)的ADG標(biāo)準(zhǔn)液,使其終濃度分別為2、5、100、150ng/mL,進(jìn)樣,記錄峰面積,得峰面積比值R(A)。另取未加基質(zhì)但加內(nèi)標(biāo)的ADG標(biāo)準(zhǔn)液,使其終濃度為2、5、100、150ng/mL,進(jìn)樣,記錄峰面積,得峰面積比值R(B)。將每組得到的峰面積比值R相比(B/A),計(jì)算ADG在血漿中別的基質(zhì)效應(yīng),結(jié)果見表2。由表2可知,該方法ADG在2、5、100、150ng/mL四個(gè)濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為112.82%、103.49%、104.11%、95.97%,內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)均值為91.58,均符合相關(guān)規(guī)定,表明不同受試大鼠的血漿基質(zhì)對ADG的質(zhì)譜信號無顯著性影響。

        表2 ADG血漿樣品的基質(zhì)效應(yīng)(n=6)

        表3 ADG血漿樣品的提取回收率(n=6)

        2.8 精密度考察 取大鼠空白血漿50μL,按“2.5”項(xiàng)下方法,分別制備ADG四個(gè)濃度(2、5、100、150ng/mL)的ADG樣品,每種濃度平行5份,重復(fù)3個(gè)分析批,每批隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線。以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的濃度,計(jì)算分析方法的日內(nèi)與日間精密度與準(zhǔn)確度。結(jié)果見表4,四個(gè)濃度下的批內(nèi)和批間RSD及RE均在QC樣品均值的15%以內(nèi),符合方法學(xué)的相關(guān)要求。

        表4 ADG血漿樣品的精密度考察(n=5)

        2.9 穩(wěn)定性考察 配制5,100,150ng/mL三種濃度的ADG血漿樣品,每個(gè)濃度平行配制3份,于-40℃條件下反復(fù)凍融3次,按“2.3”項(xiàng)下處理,用當(dāng)天現(xiàn)配血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算,結(jié)果見表5,測定結(jié)果表明,ADG血漿樣品于在上述條件下穩(wěn)定,符合相關(guān)規(guī)定。

        表5 ADG血漿樣品凍融穩(wěn)定性考察(n=3)

        2.10 動物實(shí)驗(yàn) 取SD雄性大鼠10只,體重220±20g左右,隨機(jī)分成2組,大鼠給藥前禁食12h,禁食期間自由飲水。分別以16.8mg/kg的劑量對ADG原料、糊精噴干粉的0.5%CMC-Na混懸液(以大鼠給料體積約2.1mg/mL/只計(jì)算,將樣品溶于20mL的水中溶解)進(jìn)行大鼠灌胃給藥。于給藥后的 5、10、20、45、60、90、120、180、240、360、480、720、1440min從眼眶取血,置于肝素化的EP管內(nèi),4000r/min,離心10min,移取100μL血漿轉(zhuǎn)入2mL EP管中。樣品按“2.3”項(xiàng)下處理后,渦旋離心后,取上清液2μL,進(jìn)行LC-MS/MS分析。大鼠灌胃ADG噴干粉的血藥濃度見圖2。

        圖2 ADG噴干粉的平均血藥濃度-時(shí)間曲線(,n=5)

        表6 ADG噴干粉主要藥動學(xué)參數(shù)(,n=5)

        表6 ADG噴干粉主要藥動學(xué)參數(shù)(,n=5)

        參數(shù) ADG噴干粉 ADG糊精噴干粉AUC(0-t)/ng·min·mL-1 22439.09±7299.70 69807±34901.01 t1/2 /min 226.07±57.17 579.00±415.00 Tmax /min 13±6.708 31±20.736 Cmax / ng·mL-1 79.14±5.443 244.2±122.13

        采用DAS 3.0軟件進(jìn)行藥動學(xué)參數(shù)的擬合,選擇模式為非房室模型給藥,主要藥動學(xué)參數(shù)見表6。使用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對以上藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示,ADG噴干粉與ADG 糊精噴干粉的 AUC0-t、AUC(0-inf)、Cmax、Vz/F、CL/F 均發(fā)生了顯著性變化(P<0.05),其他參數(shù)均無顯著性差異。

        3 討論

        基于文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]ADG的內(nèi)標(biāo)選擇多樣,實(shí)驗(yàn)前期考察了銀杏內(nèi)酯、三七皂苷、己烯雌酚等內(nèi)標(biāo),預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯、三七皂苷等提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)均有超出范圍,無法滿足分析要求。最終確定選用己烯雌酚為內(nèi)標(biāo),并建立了ADG的LC-MS/MS含量測定方法,該方法穩(wěn)定、精確、重現(xiàn)性好,可準(zhǔn)確測定大鼠血漿中ADG的濃度。

        由圖2顯示,ADG原料、糊精噴干粉在大鼠體內(nèi)均存在雙峰,這和文獻(xiàn)報(bào)道一致[11],說明大鼠口服ADG噴干粉制劑可能存在肝腸循環(huán)現(xiàn)象。由于ADG藥代動力學(xué)主要表現(xiàn)為體內(nèi)吸收快,生物利用度低等特征[12],ADG原料噴干粉相比于ADG糊精噴干粉的藥-時(shí)曲線雙峰現(xiàn)象不明顯,血藥濃度低、達(dá)峰時(shí)間短。由表6可知,ADG糊精噴干粉比ADG原料噴干粉在大鼠體內(nèi)口服吸收(AUC0-t)(P<0.05)提高約3倍,可能ADG糊精噴干粉經(jīng)研磨、噴霧干燥等技術(shù)避免ADG在噴霧干燥過程中發(fā)生微粉化聚集現(xiàn)象,有利于ADG細(xì)粉在水中分散,加快其在體外的溶出及體內(nèi)的吸收。

        4 結(jié)論

        本實(shí)驗(yàn)建立了ADG的LC-MS/MS含量測定方法,該方法靈敏度高,專屬性強(qiáng),能準(zhǔn)確測定大鼠血漿中ADG的含量。利用膠體磨粉碎結(jié)合噴霧干燥技術(shù)提高ADG的溶出度和生物利用度的研究國內(nèi)尚未見報(bào)道。該制備工藝簡單易行,成本較低,具有潛在的開發(fā)價(jià)值。

        參考文獻(xiàn)

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