劉 洋 董 平 郗 政 鄧志會(huì) 沈洪濤 張 彥 楊普程

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院骨外科，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

骨肉瘤(OS)是來(lái)源于間葉組織常見(jiàn)原發(fā)惡性腫瘤，OS在每個(gè)年齡段均有發(fā)病，超過(guò)3/4患者為青少年，約1/4為老年患者，且男性多于女性〔1〕。OS容易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，5年生存率較低，約為20%。臨床的主要治療為手術(shù)聯(lián)合輔助化療，但療效不甚明顯，OS生存率提高到不足50%〔2〕。OS病變復(fù)雜，尚無(wú)一個(gè)完整體系概括，但病變多在癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和自噬等方面，報(bào)道顯示，miR-195屬于微小RNA(miR)-15/16/195家族，在肝癌、結(jié)腸癌和非小細(xì)胞等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，參與癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移〔3〕；核糖體蛋白L34是核糖體蛋白 L34E家族成員，參與胃癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和抗凋亡過(guò)程〔4〕；自噬參與腫瘤細(xì)胞凋亡、耐藥及腫瘤干細(xì)胞分化增殖的調(diào)節(jié)，Beclin1作為重要的自噬相關(guān)因子，在自噬體形成過(guò)程扮演重要角色〔5〕。miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1是惡性腫瘤病變中研究較多的標(biāo)記物。本研究擬分析人OS miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 2010年4月至2012年6月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院確診為OS的患者56例，年齡60～72歲。病變部位為股骨20例、肱骨15例、脛骨15例和腓骨6例。均接受常規(guī)化療聯(lián)合手術(shù)，手術(shù)為單純腫瘤切除術(shù)或關(guān)節(jié)置換術(shù)，手術(shù)前后均接受常規(guī)化療。選擇同期骨軟骨瘤患者35例，兩組一般臨床資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組一般情況比較

1.2排除標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)前接受輔助治療；診斷時(shí)已出現(xiàn)癌轉(zhuǎn)移；預(yù)計(jì)存活時(shí)間≤6個(gè)月；存在精神障礙，不配合研究或資料不完整者。

1.3免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1的表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟和水化，枸櫞酸緩沖液熱修復(fù)抗原，冷卻至室溫以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，滴加 3%過(guò)氧化氫行過(guò)氧化物酶阻斷，PBS沖洗，滴加山羊血清封閉，去除封閉液，滴加一抗鼠抗人miR-195(1∶100)、核糖體蛋白L34(1∶20 )和兔抗人Beclin1(1∶200)，4℃孵育過(guò)夜，37℃復(fù)溫45 min，PBS沖洗，分別滴加抗鼠、生物素化和抗兔二抗(37℃孵育1.0 h)、PBS沖洗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，Mayer蘇木素復(fù)染，脫水，透明及封片，PBS緩沖液替代一抗作為對(duì)照。陽(yáng)性及半定量判斷采用雙盲法由兩位病理科醫(yī)生獨(dú)立審閱所有切片。判斷標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)視野計(jì)數(shù) 100 個(gè)細(xì)胞，依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的比率及染色度進(jìn)行判定。①陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)<10%為0分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)10%～25%為1分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)26%～50%為2分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)>50%為3分。②染色深度評(píng)分：無(wú)染色為0分；淡黃色為1分，黃色至棕黃色為2分；深黃色至深棕黃色為3分。③總積分=陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分+染色深度評(píng)分：0 分陰性(-)，≥1分陽(yáng)性(+)。采用Microdensitometer對(duì)染色切片進(jìn)行定量，每張切片測(cè)試5個(gè)區(qū)域，計(jì)算每個(gè)區(qū)域抗原的百分比，求均值，以每批切片的陰性對(duì)照調(diào)零，并對(duì)玻片校正厚度，消除玻片厚度對(duì)結(jié)果的影響。

1.4細(xì)胞壞死率為化療效果的判斷依據(jù) 化療前活檢標(biāo)本和術(shù)后切除的瘤體均行HE染色，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)存活的腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞壞死率=(化療前細(xì)胞數(shù)-化療后細(xì)胞數(shù))/化療前細(xì)胞數(shù)×100%。細(xì)胞壞死率≥90%為化療效果良好，<90%為化療效果不佳。

1.5生存分析 完成最后一次化療作為隨訪(fǎng)時(shí)間起點(diǎn)，以復(fù)診、電話(huà)、微信和E-mail方式記錄所有患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移及死亡的病例。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性行Spearman分析，生存率采用Log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達(dá) miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1分別在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核表達(dá)。與骨軟骨瘤組比，OS組miR-195和Beclin1陽(yáng)性或半定量表達(dá)明顯降低(P<0.001)，核糖體蛋白L34陽(yáng)性或半定量表達(dá)明顯增高(P<0.001)，見(jiàn)表2、表3和圖1。

表2 兩組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1陽(yáng)性表達(dá)〔n(%)〕

表3 兩組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1半定量表達(dá)

圖1 兩組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達(dá)(DAB，×200)

2.2OS組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1相關(guān)性 miR-195與核糖體蛋白L34和Beclin1分別呈負(fù)和正相關(guān)(r=-0.64,0.68,均P<0.05)，核糖體蛋白L34和Beclin1呈正相關(guān)(r=0.72,P<0.05)。

2.3miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達(dá)與化療效果的關(guān)系 miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達(dá)呈陰性、陽(yáng)性及陰性者化療效果不佳，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

2.4miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達(dá)與5年生存時(shí)間的關(guān)系 OS組均獲得5年隨訪(fǎng)，存活26例(46.43%)，死亡30例(53.57%)，轉(zhuǎn)移16例、復(fù)發(fā)12例、交通意外死亡1例、不明原因死亡1例。 miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達(dá)分別為陽(yáng)性、陰性和陽(yáng)性的患者5年生存時(shí)間均顯著較長(zhǎng)(χ2=4.207,P=0.040；χ2=4.033,P=0.045；χ2=4.858,P=0.028)，見(jiàn)圖2。

圖2 OS組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達(dá)與5年生存時(shí)間

表4 OS組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達(dá)與化療效果的關(guān)系〔n(%)〕

3 討 論

miR-195是基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼小分子RNA，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及腫瘤發(fā)生等多種病理過(guò)程〔6〕。本課題結(jié)果提示miR-195在人OS病變中起保護(hù)作用，檢測(cè)癌組織miR-195表達(dá)可評(píng)估患者預(yù)后。研究顯示〔7～11〕，miR-195在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平減少與結(jié)腸癌患者低生存率有明顯相關(guān)性，與miR-195具有抑制結(jié)腸癌癌細(xì)胞侵襲及遷移相關(guān)；原位雜交顯示miR-195在轉(zhuǎn)移前列腺癌組織中的表達(dá)顯著低于非轉(zhuǎn)移前列腺癌組織，在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)的miR-195能夠抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力,同時(shí)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化常見(jiàn)標(biāo)識(shí)蛋白波形蛋白及N-鈣黏素水平降低。miR195可作為靶向調(diào)控的化療干預(yù)。

核糖體蛋白L34 是一種保守的核糖體蛋白，在惡性腫瘤中均表現(xiàn)出核糖體外功能〔4,12,13〕，如人胃癌細(xì)胞株 SGC-7901 的核糖體蛋白L34 表達(dá)敲減可增加細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，迫使細(xì)胞分裂周期阻滯在 S 期，核糖體蛋白L34 高表達(dá)可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1299增殖，且在非小細(xì)胞肺癌組織呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)，核糖體蛋白L34 在人胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)，參與抑癌基因 RPL34基因啟動(dòng)子的甲基化過(guò)程，該過(guò)程降低了RPL34基因的抑癌作用。敲除核糖體蛋白L34可有效抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和耐藥性，致使胰腺癌細(xì)胞停滯于G2 期進(jìn)而凋亡，可見(jiàn)核糖體蛋白L34參與癌細(xì)胞的增殖、周期及抗凋亡過(guò)程，上述作用可能與核糖體蛋白34 表達(dá)改變絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/p53 信號(hào)通路活性相關(guān)，MAPK/p53 信號(hào)有助于調(diào)控癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移〔14〕。本課題結(jié)果顯示核糖體蛋白L34在人OS呈高表達(dá)，參與人OS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

Beclin1參與腫瘤細(xì)胞自噬，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑瘤和促瘤雙重作用〔5,15〕。一方面，Beclin1可通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的自噬活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性凋亡，抑制腫瘤的發(fā)展。該作用較典型地表現(xiàn)在肝癌、卵巢癌和前列腺癌等惡性腫瘤中， Beclin1基因缺失或突變，Beclin1表達(dá)也呈下調(diào)狀態(tài)〔16,17〕。另一方面，Beclin1 可通過(guò) PI3K 通路形成自噬復(fù)合物，抑制下游信號(hào)通路p53，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)展，例如在胃癌和肺癌的表達(dá)是上調(diào)的，隨著腫瘤級(jí)別的增高而表達(dá)增高〔18〕。本課題Beclin1 陽(yáng)性表達(dá)的OS患者5年生存率明顯高于陰性表達(dá)的患者，以往也有類(lèi)似報(bào)道〔19〕，而且Beclin1 陽(yáng)性表達(dá)的患者化療效果較好，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與納入案例較少有關(guān)。離體研究也顯示，Beclin1基因過(guò)表達(dá)可以激活人OS MG63細(xì)胞株的凋亡，抑制其增殖〔18〕。可見(jiàn)人OS中Beclin1依賴(lài)的腫瘤自噬表現(xiàn)出抑瘤機(jī)制，增強(qiáng)機(jī)體的依賴(lài)Beclin1 型腫瘤自噬有助于治療腫瘤，改善患者生存狀態(tài)。

綜上，人OS患者miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達(dá)水平與預(yù)后密切相關(guān)，miR-195和Beclin1表達(dá)水平越高，核糖體蛋白L34表達(dá)越低，預(yù)后較好。

1Takahashi Y,Yasui T,Tamari K.Radiation enhanced the local and distant anti-tumor efficacy in dual immune checkpoint blockade therapy in osteosarcoma〔J〕.PLoS One,2017;12(12):e0189697.

2Liu YJ,Li W,Chang F.MicroRNA-505 is downregulated in human osteosarcoma and regulates cell proliferation,migration and invasion〔J〕.Oncol Rep,2018;39(2):491-500.

3Zhou S,Yu L,Xiong M,etal.LncRNA SNHG12 promotes tumorigenesis and metastasis in osteosarcoma by upregulating Notch2 by sponging miR-195-5p〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2017;9(17):32439-7.

4Luo S,Zhao J,Fowdur M.Highly expressed ribosomal protein L34 indicates poor prognosis in osteosarcoma and its knockdown suppresses osteosarcoma proliferation probably through translational control〔J〕.Sci Rep,2016;6(11):37690.

5Liu Y,Zhang Y,Zou J,etal.Andrographolide induces autophagic cell death and inhibits invasion and metastasis of human osteosarcoma cells in an autophagy-dependent manner〔J〕.Cell Physiol Biochem,2017;44(4):1396-410.

6Cheng D,Qiu X,Zhuang M,etal.MicroRNAs with prognostic significance in osteosarcoma:a systemic review and meta-analysis〔J〕.Oncotarget,2017;8(46):81062-74.

7Qu Q,Chu X,Wang P.MicroRNA-195-5p suppresses osteosarcoma cell proliferation and invasion by suppressing naked cuticle homolog 1〔J〕.Cell Biol Int,2017;41(3):287-95.

8Zhou Q,Chen F,Zhao J,etal.Long non-coding RNA PVT1 promotes osteosarcoma development by acting as a molecular sponge to regulate miR-195〔J〕.Oncotarget,2016;7(50):82620-33.

9Han K,Chen X,Bian N,etal.MicroRNA profiling identifies MiR-195 suppresses osteosarcoma cell metastasis by targeting CCND1〔J〕.Oncotarget,2015;6(11):8875-89.

10Lian F,Cui Y,Zhou C,etal.Identification of a plasma four-microRNA panel as potential noninvasive biomarker for osteosarcoma〔J〕.PLoS One,2015;10(3):e0121499.

11Cai H,Zhao H,Tang J,etal.Serum miR-195 is a diagnostic and prognostic marker for osteosarcoma〔J〕.J Surg Res,2015;194(2):505-10.

12Fan H,Li J,Jia Y,etal.Silencing of ribosomal protein L34(RPL34) inhibits the proliferation and invasion of esophageal cancer cells〔J〕.Oncol Res,2017;25(7):1061-8.

13Wei F,Ding L,Wei Z,etal.Ribosomal protein L34 promotes the proliferation,invasion and metastasis of pancreatic cancer cells〔J〕.Oncotarget,2016;7(51):85259-72.

14Liu H,Liang S,Yang X,etal.RNAi-mediated RPL34 knockdown suppresses the growth of human gastric cancer cells〔J〕.Oncol Rep,2015;34(5):2267-72.

15Tao H,Chen F,Liu H,etal.Wnt/β-catenin signaling pathway activation reverses gemcitabine resistance by attenuating Beclin1-mediated autophagy in the MG63 human osteosarcoma cell line〔J〕.Mol Med Rep,2017;16(2):1701-6.

16Ma K,Zhang C,Huang MY,etal.Crosstalk between Beclin-1-dependent autophagy and caspase dependent apoptosis induced by tanshinone ⅡA in human osteosarcoma MG-63 cells〔J〕.Oncol Rep,2016;36(4):1807-18.

17Xu R,Liu S,Chen H,etal.MicroRNA-30a downregulation contributes to chemoresistance of osteosarcoma cells through activating Beclin-1-mediated autophagy〔J〕.Oncol Rep,2016;35(3):1757-63.

18Zhang W,Li Q,Song C,etal.Knockdown of autophagy-related protein 6,Beclin-1,decreases cell growth,invasion,and metastasis and has a positive effect on chemotherapy-induced cytotoxicity in osteosarcoma cells〔J〕.Tumour Biol,2015;36(4):2531-9.

19Wu W,Li W,Zhou Y,etal.Inhibition of beclin1 affects the chemotherapeutic sensitivity of osteosarcoma〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2014;7(10):7114-22.