張雙元 梅士娟 劉震 張晨如 措羊 米曉琳 董顯花 孔令達(dá)

（1青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科二科 青海 西寧 810001）

（2青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部 青海 西寧 810001）

乳腺癌是嚴(yán)重影響中國女性健康的疾病之一，出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是最主要的死亡原因，因此，控制復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移對降低乳腺癌患者的死亡率具有決定性作用[1]。異黏蛋白(metadherin，MTDH)最早是在感染了人免疫缺陷病毒(HIV-1)的人原始胚胎星形細(xì)胞中被克隆出來的，在多種腫瘤組織中高度表達(dá)。體內(nèi)外研究也發(fā)現(xiàn)，MTDH 基因的表達(dá)可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長、增殖等，進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移[2]。為了明確青海地區(qū)乳腺癌患者外周靜脈血液中MTDH的表達(dá)狀況，本文采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reactio,PCR ）法進(jìn)行了初步研究。

1.實驗材料

1.1 材料來源

收集2015年1月至2016年12月，青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科二科收治的41例乳腺癌患者和47例健康對照組人群的新鮮外周靜脈血液各1.5ml，提取RNA。

1.2 試劑

外周靜脈血檢測MTDH的表達(dá)用PCR法檢測。TRI Reagent?BD試劑、紅細(xì)胞裂解液、TIANScript RT Kit cDNA第一鏈合成試劑盒、2×PCR MasterMix、D2000 Marker、DNase/RNase-Free 去離子水及其它分子生物學(xué)試劑均購自北京天根生物化學(xué)試劑公司。

1.3 試驗方法

外周靜脈血檢測MTDH的表達(dá)用PCR法檢測。

1.3.1 總RNA完整度的檢測 采用Trizol一步法提取的血液總RNA經(jīng)電泳檢測可見清晰的28S和18S兩條rRNA條帶，其中28S條帶亮度兩倍于18S帶（圖1），表明組織總RNA完整性良好。

1.3.2 檢測基因循環(huán)數(shù)確定

（1）GAPDH內(nèi)參基因

GAPDH內(nèi)參基因擴增循環(huán)數(shù)從20次增至29次，每個循環(huán)取出1管，進(jìn)行電泳分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)循環(huán)數(shù)進(jìn)入24時，已經(jīng)達(dá)到指數(shù)擴增的初中期，因此，確定24為后期實驗檢測循環(huán)數(shù)。

圖1 血液總RNA提取電泳圖

圖2 GAPDH內(nèi)參基因循環(huán)數(shù)電泳圖與光密度分析

（2）MTDH基因

MTDH基因擴增循環(huán)數(shù)從26次增至35次，每個循環(huán)取出1管，進(jìn)行電泳分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)循環(huán)數(shù)進(jìn)入29時，已經(jīng)達(dá)到指數(shù)擴增的初中期，因此，確定29為后期實驗檢測循環(huán)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計方法

全部實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析處理。使用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 MTDH基因循環(huán)數(shù)電泳圖與光密度分析

2.結(jié)果

（1）組間MTDH基因表達(dá)變化檢測

用凝膠分析系統(tǒng)分析實驗結(jié)果，測出目的基因及內(nèi)參照的灰度值，并計算二者的比值，為mRNA相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，乳腺癌患者和正常健康對照組間MTDH基因mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 部分MTDH和GAPDH內(nèi)參基因擴增電泳圖

（2）乳腺癌組和對照組血液MTDH基因mRNA表達(dá)

乳腺癌組外周血MTDH基因mRNA表達(dá)(0.81±0.66)，健康組外周血MTDH基因mRNA表達(dá)(0.64±0.55)，P=0.019，統(tǒng)計學(xué)具有差異。見表。

表 乳腺癌組和對照組血液MTDH基因mRNA表達(dá)

3.討論

近年來，乳腺癌已成為威脅女性健康的主要原因之一。乳腺癌是全身性疾病，早期就有可能發(fā)生全身微轉(zhuǎn)移，因此，即使一開始就對患者實行手術(shù)、放療、化療的綜合性治療，仍有一部分患者會發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。分子生物學(xué)研究表明，抑癌基因的滅活、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常、癌基因的激活等因素，對乳腺癌發(fā)生和發(fā)展起關(guān)鍵作用。因此迫切需要繼續(xù)在分子水平研究乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，尋找其他的治療途徑，進(jìn)一步提高乳腺癌的治療效果[3]。

異黏蛋白(metadherin，MTDH)，又被命名為星狀細(xì)胞上調(diào)基因-1（astroycyte elevated gen-1，AEG-1）。MDTH是原癌基因，定位于染色體8q22.1，是存在于核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核仁內(nèi)的跨膜蛋白，其功能是調(diào)節(jié)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子信號途徑。MDTH參與惡性腫瘤的進(jìn)展的主要過程，包括腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化、促進(jìn)腫瘤血管生成、抵抗化療藥物、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和生長。MTDH在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，且與惡性程度的增高呈正相關(guān)，如肝癌、黑色素瘤、前列腺癌等，而在良性組織或正常組織中則不表達(dá)或低表達(dá)。有研究認(rèn)為，敲除MTDH基因可以提高乳腺癌細(xì)胞對多種化療藥物的敏感性，如順鉑、阿霉素和紫杉醇。因此我們可以初步判斷MTDH有可能為龐大的、繁雜的腫瘤信號網(wǎng)絡(luò)通路中的一個關(guān)鍵位點，是調(diào)節(jié)惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要分子。

有關(guān)青海地區(qū)乳腺癌患者外周靜脈血MTDH基因的表達(dá)狀況尚未見報道。本研究采用PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在青海地區(qū)乳腺癌患者外周血中MTDHmRNA為0.81±0.66，健康組外周血MTDH基因mRNA表達(dá)為0.64±0.55，提示MTDH基因在青海乳腺癌患者中處于高表達(dá)狀態(tài)。

綜上所述，我們初步斷定，MTDH在青海地區(qū)對乳腺癌的發(fā)生和疾病進(jìn)展或有著重要的作用，需要進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1]張思維，陳萬青，孔靈芝，等.中國部分市縣2003年惡性腫瘤發(fā)病年度報告[J].中國腫瘤，2007，16(7)：503.

[2]Emdad L，Sarkar D, Su ZZ，et a1.Astrocyte elevated gene-1：recent insights into a novel gene involved in tumor progression,metastasis and neurodegeneration[J].Pharmacol Ther.2007.114：155-170.

[3]Yoo BK, Emdad L, Su ZZ, et al.Astrocyte elevated gene-1 regulates hepatocellular carcinoma developmenl and progression[J].J Clin In.vest 2009.119：465-469.