廖曉棠，廖明媚

(1.中南大學(xué) 湘雅醫(yī)院 衛(wèi)生部納米生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410008；2.湖南省藥品審評(píng)認(rèn)證與不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410013)

糖化血紅蛋白(HbA1c)是葡萄糖與人體血液中紅細(xì)胞β-鏈纈氨酸N末端通過(guò)非酶促反應(yīng)結(jié)合的產(chǎn)物[1-2]，由于該反應(yīng)是不可逆反應(yīng)，與血糖濃度成正比，能反映2～3個(gè)月血糖的平均水平，因此臨床上通過(guò)測(cè)定HbA1c了解患者血糖的控制情況，也是糖尿病等診斷非常重要的指標(biāo)[3-5]。

HbA1c的檢測(cè)方法主要有陽(yáng)離子交換色譜法、電泳法、親和層析法、免疫分析法、離子層析法和酶法等[6-9]。高效液相色譜法作為檢測(cè)HbA1c的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確度高，但預(yù)處理、周轉(zhuǎn)時(shí)間長(zhǎng)，操作復(fù)雜，儀器和檢測(cè)成本高，不利于推廣。目前臨床采用酶法，其原理為將HbA1c的β亞單位進(jìn)行水解，利用酶促反應(yīng)氧化果糖酰纈氨酸檢測(cè)過(guò)程中生成的過(guò)氧化氫[10]；但該方法受到色原物質(zhì)和樣品自身顏色的干擾，易產(chǎn)生誤差。電化學(xué)方法具有靈敏度高以及不受樣品自身顏色干擾的特點(diǎn)，且基于絲網(wǎng)印刷技術(shù)的電化學(xué)傳感器具有成本低、易操作以及便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，具有較大的發(fā)展前景[11-14]。

圖1 糖化血紅蛋白的檢測(cè)原理圖Fig.1 Schematic diagram of the glyeosylated hemoglobin detection

網(wǎng)狀玻璃態(tài)碳(RVC)由玻璃態(tài)碳泡沫構(gòu)成，孔隙率達(dá)90%～97%，該多孔材料比表面積大，對(duì)液體流動(dòng)的阻力小，適用于流動(dòng)注射系統(tǒng)[15-16]。由于硼酸基團(tuán)能與HbA1c中的順位二醇基結(jié)合，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)氨基苯硼酸修飾的磁性納米粒子捕獲樣本中的糖化血紅蛋白。在絲網(wǎng)印刷電極表面采用殼聚糖和正硅酸乙酯作為碳納米管的分散劑，將納米管固定形成溶膠-凝膠膜后用于血紅蛋白和糖化血紅蛋白的直接電化學(xué)檢測(cè)。其反應(yīng)原理如圖1所示，當(dāng)全血加入對(duì)氨基苯硼酸修飾的磁性納米粒子(MNP)溶液中后，HbA1c與磁性納米粒子結(jié)合，注射至流動(dòng)池中，在磁性作用下，HbA1c與MNP共同吸附在RVC電極上，而游離的Hb在絲網(wǎng)印刷電極(SPE)被電化學(xué)檢測(cè)，當(dāng)移除磁體時(shí)，HbA1c隨緩沖溶液流入至SPE表面而被電化學(xué)檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；LC-400P絲網(wǎng)印刷機(jī)(東莞聯(lián)昌實(shí)業(yè)有限公司)。FeCl2、FeCl3、對(duì)氨基苯硼酸、羧甲基葡聚糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、2-(環(huán)己胺)-1-乙磺酸、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基磺酸鈉(SDS)均購(gòu)于Sigma公司；氯化銀漿購(gòu)自徐州英劍納米科技有限公司；導(dǎo)電碳漿和絕緣油墨購(gòu)自日本十條公司。所有溶液均用二次去離子水配制。

1.2 對(duì)氨基苯硼酸修飾磁性納米粒子的制備

圖2 對(duì)氨基苯硼酸修飾的磁性納米粒子的透射電鏡形貌圖Fig.2 TEM image of magnetic nanoparticles modified with 3-aminophenylboronic acid

將10 mL 0.05 mmol/L的 FeCl2和10 mL 0.10 mmol/L 的FeCl3溶液倒入三口燒瓶中，加入50 mL 5 mg/mL的羧甲基葡聚糖溶液，通入氮?dú)猓俚渭?8%的氨水3 mL。室溫下將混合溶液超聲處理10 min，升溫至80 ℃反應(yīng)60 min，將樣品洗滌至中性，冷凍干燥，得到羧甲基葡聚糖改性磁性納米粒子。取4 mg/mL磁性納米粒子溶液1 mL，加入5 mmol/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和5 mmol/L N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的PBS溶液中，混合均勻，室溫下活化羧基3 h，磁場(chǎng)下分離，分離后用去離子水洗滌磁性納米粒子，加入1 mL的PBS溶液(pH 7.2)，將其放入10 mmol/L 對(duì)氨基苯硼酸溶液中反應(yīng)1 h，并加入5 mmol/L甘氨酸溶液以封閉RVC上未參與反應(yīng)的羧基，用PBS反復(fù)清洗，加入1 mL 100 mmol/L pH 9.0 的2-(環(huán)己胺)-1-乙磺酸、1%聚乙二醇辛基苯基醚和0.45%SDS，在4 ℃保存。對(duì)氨基苯硼酸修飾磁性納米粒子在pH 9.0條件的Zeta電位為-32 mV，分散性較好，不易團(tuán)聚，粒徑約為150 nm，圖2為其透射電鏡形貌圖(TEM)。

1.3 電極的制備

將RVC制成直徑3 mm、長(zhǎng)5 mm的工作電極，塞入至特氟龍制成的圓柱狀流動(dòng)池中。絲網(wǎng)印刷電極含有1個(gè)工作電極和1個(gè)參比電極。將氯化銀漿印制在聚酯膜上，75 ℃烘干10 min，形成對(duì)比電極；將碳漿印制在聚酯膜上另一端，110 ℃烘干15 min，形成工作電極，在對(duì)比電極和工作電極之間印制一層絕緣油墨，75 ℃烘干10 min，固定絲網(wǎng)印刷電極的反應(yīng)區(qū)。將絲網(wǎng)印刷電極反應(yīng)區(qū)浸入10 μL含有CS、TEOS和碳納米管(質(zhì)量比1∶1∶1)的混合溶液中放置1 h，于45 ℃干燥10 min，室溫干燥保存。由于RVC具有較大的表面積，當(dāng)加置磁體時(shí)，對(duì)氨基苯硼酸修飾磁性納米粒子結(jié)合的HbA1c能有效地吸附在RVC電極表面，可通過(guò)循環(huán)伏安法(CV)對(duì)下游的絲網(wǎng)印刷電極進(jìn)行表征。通過(guò)檢測(cè)不同濃度的Hb氧化反應(yīng)電流，重復(fù)性偏差在2%以內(nèi)。

1.4 臨床樣本測(cè)試

將采集的5 mL靜脈血液置于肝素鈉的抗凝管中，取其中1份用全自動(dòng)生化儀進(jìn)行酶法測(cè)試。另取10 μL加入10 μL含對(duì)氨基苯硼酸修飾的磁性納米粒子、2-(環(huán)己胺)-1-乙磺酸、聚乙二醇辛基苯基醚和0.45%SDS的溶血?jiǎng)?，反?yīng)10 s后注入RVC流動(dòng)池中，利用I～t方法測(cè)定樣本中Hb和HbA1c的電量，通過(guò)電量比計(jì)算HbA1c的比例。

2 結(jié)果與討論

2.1 Hb與HbA1c在絲網(wǎng)印刷電極的電化學(xué)行為

圖3 掃描速度為100 mV/s時(shí)絲網(wǎng)印刷電極在不同溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of various solution at the screen printed electrode with scan rate of 100 mV/sa：100 mg/mL hemoglobin；b：2 mg/mL glyeosylated hemoglobin；c：PBS solution

采用循環(huán)伏安法(CV)研究了對(duì)血紅蛋白(Hb)和糖化血紅蛋白(HbA1c)在殼聚糖(CS)、正硅酸乙酯(TEOS)和碳納米管構(gòu)成的溶膠-凝膠膜修飾絲網(wǎng)印刷電極上的電化學(xué)行為。由于Hb是一種亞血紅素蛋白質(zhì)，含有4個(gè)含鐵的亞鐵血紅素，而鐵離子包埋在Hb內(nèi)部，電活性中心很難到達(dá)電極表面，因此很難在電極表面發(fā)生直接的電化學(xué)氧化還原反應(yīng)。碳納米管則具備高電導(dǎo)性，能促進(jìn)電子的轉(zhuǎn)移速率，利用TEOS 和CS進(jìn)行交聯(lián)將碳納米管覆蓋在絲網(wǎng)印刷電極表面后，能促進(jìn)Hb和HbA1c中亞鐵血紅素的電子轉(zhuǎn)移。如圖3所示，100 mg/mL 的Hb在-0.70～0.10 V范圍內(nèi)呈現(xiàn)1對(duì)較好的氧化還原峰，氧化、還原峰電位分別為-0.20 V和-0.35 V;2 mg/mL HbA1c的氧化、還原峰電位分別為-0.24 V和-0.34 V。該氧化還原峰主要由亞鐵血紅素在絲網(wǎng)印刷電極表面發(fā)生的氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生，表明碳納米管能夠促進(jìn)亞鐵血紅素和絲印電極之間的電子傳遞，且Hb和HbA1c在絲印電極上發(fā)生了直接氧化還原反應(yīng)。

2.2 絲網(wǎng)印刷電極的抗干擾性

電化學(xué)方法測(cè)定實(shí)際血樣時(shí)，電化學(xué)響應(yīng)常受其他氧化還原物質(zhì)的干擾，如尿酸(UA)和抗壞血酸(AA)。這些物質(zhì)通常與介體具有相近的氧化還原電位。因此，考察了在生理?xiàng)l件下，0.03 mg/mL的UA和0.03 mg/mL AA對(duì)CS、TEOS和碳納米管修飾絲網(wǎng)印刷電極測(cè)定Hb的干擾。當(dāng)電位大于0.10 V時(shí)，UA和AA在絲網(wǎng)印刷電極的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)隨著電位的升高而增大，該信號(hào)主要?dú)w結(jié)于UA和AA在電極表面的直接氧化還原反應(yīng)。當(dāng)電位在-0.10～0.10 V時(shí)，電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)基本不變，而低于-0.10 V時(shí)，電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)則隨著電位的升高而增加，表明Hb在電極表面氧化反應(yīng)不完全。其他干擾物質(zhì)(如多巴胺、對(duì)乙酰氨基酚和膽紅素)在0.10 V 的電位下均不會(huì)對(duì)絲網(wǎng)印刷電極產(chǎn)生影響。同時(shí)考察了不同濃度干擾物質(zhì)對(duì)電極的影響，結(jié)果表明僅抗壞血酸濃度高于0.1 mg/mL時(shí)對(duì)電極產(chǎn)生干擾，這主要是由于高濃度的抗壞血酸吸附在RVC電極表面所致，當(dāng)提高流動(dòng)注射的速率時(shí)，干擾逐漸降低，而其他物質(zhì)均無(wú)影響。因此，在0.10 V測(cè)定Hb的氧化還原基本不受血液樣本中氧化還原物質(zhì)的干擾，具有較好的抗干擾能力，該方法可用于實(shí)際樣本中HbA1c和Hb濃度的檢測(cè)。

2.3 Hb及HbA1c濃度與絲網(wǎng)印刷電極反應(yīng)的電量關(guān)系

研究顯示，絲網(wǎng)印刷電極電位為0.1 V時(shí)，隨著Hb和HbA1c濃度的增大，電流增加，且Hb質(zhì)量濃度在30～240 mg/mL范圍時(shí)，電量(Q,10-4C)與Hb的質(zhì)量濃度(mg/mL)呈較好的線性關(guān)系，校正曲線方程為Q=0.017 [Hb]+1.16，相關(guān)系數(shù)r=0.997 0，信噪比為3時(shí)的檢出限為6 mg/mL。由于磁性納米粒子具有較好的富集作用，當(dāng)HbA1c與磁性納米粒子的修飾基團(tuán)對(duì)氨基苯硼酸結(jié)合，通過(guò)RVC流動(dòng)池時(shí)，由于磁性作用，HbA1c在RVC中富集，當(dāng)磁性消失時(shí)，HbA1c流動(dòng)到絲網(wǎng)印刷電極表面從而被檢測(cè)。當(dāng)HbA1c質(zhì)量濃度為0.4～20.0 mg/mL時(shí)，其與電量(10-4C)之間存在良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Q=0.048[HbA1c]+0.52，信噪比為3時(shí)的檢出限為0.05 mg/mL。

2.4 絲網(wǎng)印刷電極的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

為了測(cè)試摻雜CS、TEOS和碳納米管構(gòu)成的溶膠-凝膠膜修飾絲網(wǎng)印刷電極的重復(fù)性和穩(wěn)定性，使用HbA1c與Hb濃度比例為5.5%的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)試，連續(xù)測(cè)試10次，結(jié)果表明不同的絲網(wǎng)印刷電極具有較好的重現(xiàn)性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.3%。

將同一批次的絲網(wǎng)印刷電極干燥保存在室溫下，RVC流動(dòng)池通過(guò)注射純化水進(jìn)行保存，每隔7 d對(duì)絲網(wǎng)印刷電極進(jìn)行測(cè)試。35 d后絲網(wǎng)印刷電極測(cè)得HbA1c濃度減少0.21%，表明該電極具有較好的穩(wěn)定性，這主要是由于RVC和溶膠-凝膠包覆的碳納米管具有較好的穩(wěn)定性。

圖4 實(shí)際樣品的安培響應(yīng)圖Fig.4 Amperometric responses of the real sample detectiona.the response of Hb at the screen printed electrode when install the magnet;b.the response of HbA1c at the screen printed electrode when remove the magnet

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)試

將采集的2 mL靜脈血液置于含有肝素鈉的抗凝管中，取其中1份用全自動(dòng)生化儀進(jìn)行酶法測(cè)試。另取10 μL加入10 μL含有對(duì)氨基苯硼酸修飾的磁性納米粒子、2-(環(huán)己胺)-1-乙磺酸、聚乙二醇辛基苯基醚和0.45%SDS的溶血?jiǎng)?，反?yīng)10 s后注射到RVC流動(dòng)池中，如圖4a所示，當(dāng)加入磁性物質(zhì)時(shí)，絲網(wǎng)印刷電極響應(yīng)為Hb的氧化反應(yīng)電流;當(dāng)反應(yīng)電流趨于平衡時(shí)移除磁性物質(zhì)，絲網(wǎng)印刷電極出現(xiàn)較大的電流響應(yīng)，主要是HbA1c在電極的氧化反應(yīng)(圖4b)，利用I～t方法可測(cè)出樣本中HbA1c的比例。

由表1可知，電化學(xué)測(cè)定的結(jié)果和醫(yī)院常用方法(全自動(dòng)生化儀)的測(cè)定結(jié)果基本一致，表明該絲網(wǎng)印刷電極能有效地對(duì)全血樣品中的HbA1c進(jìn)行檢測(cè)?；诹鲃?dòng)注射和絲網(wǎng)印刷電極的HbA1c生物傳感器成本低，操作簡(jiǎn)便，能滿足臨床應(yīng)用的需求。

表1 電化學(xué)方法和全自動(dòng)生化儀測(cè)定血液樣品中的 HbA1c含量的比較Table 1 Comparison of content of HbA1c determined by hospital and this method (%)

3 結(jié) 論

本文制備了對(duì)氨基苯硼酸修飾的磁性納米粒子以及殼聚糖(CS)、正硅酸乙酯(TEOS)和碳納米管構(gòu)成的溶膠-凝膠膜修飾絲網(wǎng)印刷電極，實(shí)現(xiàn)了對(duì)血紅蛋白(Hb)和糖化血紅蛋白(HbA1c)的電化學(xué)檢測(cè)。在0.10 V電位下，絲網(wǎng)印刷電極的電量與HbA1c和Hb的質(zhì)量濃度有較好的線性關(guān)系，檢出限分別為6 mg/mL和0.05 mg/mL。該傳感器采用非酶電極且無(wú)需抗體修飾，有效降低了成本，能實(shí)現(xiàn)HbA1c分析的重復(fù)利用，且與同類HbA1c電化學(xué)傳感器相比，該方法能同時(shí)測(cè)量HbA1c和Hb的濃度，有效排除抗壞血酸(UA)和尿酸(AA)的干擾，具有較好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度，具備測(cè)定HbA1c的臨床應(yīng)用潛力。

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