劉 舉，宮 雪，徐 亮*，張 力，宮 平

(1.遼寧大學 藥學院，遼寧 沈陽 110036;2.遼寧大學 生命科學院，遼寧 沈陽 110036;3.沈陽藥科大學 基于靶點的藥物設計與研究教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110016)

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是一種人體血漿內十分重要的、含量最為豐富的蛋白質，約占血清總蛋白的60%。HSA可與許多內源性和外源性物質(如氨基酸、膽紅素、代謝物、脂肪酸、金屬離子、藥物等) 結合，具有存儲和轉運的重要功能[1]。因此，HSA通常被用作研究生物活性物質與蛋白質相互作用的模型蛋白。HSA的三維晶體結構由585個氨基酸殘基組成，包含3條同源的α-螺旋結構域：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。每條結構域各自均包含A和B兩個亞結構域，例如ⅡA或者ⅡB。每個主結構域中的兩個亞結構域均以槽口相對的方式形成圓筒狀結構。幾乎所有疏水性氨基酸均包埋在圓筒腔內部，形成疏水腔[2]。Sudlow等[3]研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)藥物在HSA上主要有兩個結合位點：SiteⅠ和SiteⅡ，分別位于亞結構域ⅡA 和ⅢA的疏水腔內。

圖1 LJC-116的分子結構Fig.1 Molecular structure of LJC-116

LJC-116(如圖1)是對Type Ⅱ類小分子c-Met激酶抑制劑的4-苯氧基喹啉這一基本母核進行結構改造，運用拼合原理、電子等排原理，將具有抗腫瘤作用的藥效團引入母核中，從而設計成的具有全新結構的4-苯氧基喹啉類Type Ⅱ型小分子c-Met激酶抑制劑。該化合物以3-甲氧基4-羥基苯乙酮為原料經14步反應合成制得，分子式為：C34H35F2N7O5，分子量：659.27。體外抗腫瘤活性測試表明該化合物具有較好的抗腫瘤活性，該化合物對HT-29、H460、A549、MKN-45的抗增殖活性均與N-[3-氟-4-[[6-甲氧基-7-[[3-(嗎啉-4-基)丙基]氧]喹啉-4-基]氧]苯基]-N′-(4-氟苯基)環(huán)丙烷-1,1-二甲酰胺(Foretinib)相當，其IC50值分別為0.080、0.14、0.11、0.030 μmol/L[4]。

目前，作為全新合成的具有抗腫瘤活性的小分子c-Met激酶抑制劑，LJC-116與HSA相互作用的研究尚未見報道。為此，本文考察了在模擬生理條件下，LJC -116與HSA的體外結合性質。利用熒光探針競爭實驗研究了LJC-116與HSA的結合部位。采用熒光光譜法以及結合反應的熱力學性質計算了結合作用的驅動力。通過雙對數(shù)方程計算了兩者之間的結合常數(shù)，利用熒光光譜、紫外光譜法結合F?rster偶極-偶極非輻射能量轉移理論方程計算了兩者之間的能量轉移效率以及結合距離。本研究有望為小分子c-Met激酶抑制劑類藥物的體內轉運情況研究提供一定的有用信息，同時也有助于了解藥物對蛋白質結構和功能的影響。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

LJC-116[4]合成提純后直接用于本研究。HSA(美國Sigma公司);氯化鈉(NaCl)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自國藥集團化學試劑有限公司;布洛芬(Ibuprofen)、華法林(Warfarlin)購自安耐吉化學試劑有限公司；實驗用水為蒸餾水。

UV-2550型紫外-可見分光光譜儀(日本島津公司);F-7000型熒光光譜儀(日本日立公司);AL204型分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);微量進樣器(上海安亭微量進樣器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1溶液配制及光譜測定方法HSA儲備液用Tris-HCl-NaCl(pH 7.4)緩沖溶液溶解后放置于冰箱冷藏保存；LJC-116與布洛芬、華法林儲備液的配制均先將相應藥品溶于少量乙醇后，再用Tris-HCl-NaCl緩沖溶液稀釋至適當濃度。

288、299、310 K 3個溫度下熒光光譜測定、熒光的內濾光效應校正、288 K下紫外光譜測定以及288 K下熒光探針實驗見文獻[5-8]。

1.2.2分子對接研究使用分子對接軟件AutoDock 4.2.5.1和AutoDock Tools 1.5.6研究LJC-116和HSA之間的相互作用。分子對接需要LJC-116和HSA的三維結構。對于LJC-116，首先使用ChemDraw繪制出其二維結構，然后使用Chem 3D生成三維結構。HSA蛋白的三維結構下載于PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb)，其PDB ID為1AO6，然后使用Pymol 1.8.2.0將三維結構中所有水分子去除，并添加極性氫原子。在分子對接前，使用AutoDock Tools 1.5.6為LJC-116和HSA添加Gasteiger電荷，合并非極性氫，并將原子轉換為AutoDock類型。分子對接時的盒子中心坐標為33.175，30.604，34.136，盒子大小為70×70×70格點，其中格點間距離為0.375 ?。對接過程中能量優(yōu)化采用拉馬克遺傳算法，評價函數(shù)使用半經驗自由能評價函數(shù)，遺傳算法最大搜索步數(shù)和最大代數(shù)分別設為25 000 000和27 000，其余參數(shù)均為默認值。對接共產生100個LJC-116與HSA的結合構象，根據(jù)構象的聚類與結合能分布情況選擇合適的結合構象進行分析。本研究使用了PyMOL 1.8.2.0和Ligplot+1.4.5[9]對結合構象進行可視化分析。

2 結果與討論

2.1 LJC-116濃度對HSA紫外光譜的影響

圖2 不同濃度LJC-116存在下HSA的紫外吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra of HSA in different concentrations of LJC-116[LJC-116](a-e) ：0.5,1.0,1.5,2.0,2.5(×10-5 mol/L); [LJC-116](f-k) ：0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5(×10-5 mol/L)，[HSA](f-k) ：5.0×10-6 mol/L；T=288 K

LJC-116濃度對HSA紫外光譜的影響見圖2。從圖2可以看出，HSA在280 nm處有最大吸收峰，而LJC-116 的吸收峰位于295 nm和320 nm，兩者的吸收光譜部分重疊。加入LJC-116 后，隨著LJC-116 濃度的增加，HSA 在280 nm處的吸收峰位略有紅移。說明LJC-116 使包埋在HSA 分子內部的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)殘基部分裸露于水相，同時疏水基團之間的疏水作用增強，引起電子軌道躍遷能量減小，造成HSA的紫外吸收光譜圖表現(xiàn)出吸收峰紅移。在320 nm處，對比加入LJC-116后的HSA吸光度值與兩者單純吸光度值之和發(fā)現(xiàn)：AHSA+ALJC-116

圖3 LJC-116與HSA相互作用的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of HSA+LJC-116 solutions LJC-116 concentration(a-f)：0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5×10-5 mol/L；[HSA]=5.0×10-6 mol/L,T=299 K

2.2 熒光光譜討論

2.2.1LJC-116對HSA猝滅方式的確定HSA的內源熒光主要來自Trp和Tyr，圖3為HSA在不同濃度LJC-116存在下的熒光發(fā)射光譜。 隨著LJC-116濃度的增加，HSA的內源熒光(280 nm激發(fā))呈規(guī)律性降低，同時峰位稍有紅移(0.3 nm)，表明HSA與LJC-116發(fā)生了作用，氨基酸殘基所處微環(huán)境極性增加。

HSA溶液的熒光發(fā)射峰位于348 nm處。 測定HSA在288、299、310 K 3個溫度下的熒光光譜數(shù)據(jù)，利用 Stern-Volmer(S-V)方程，計算了LJC-116+HSA體系的猝滅常數(shù)[7]。

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

各參數(shù)含義見文獻[10]。 根據(jù)式(1)以F0/F對[Q]作圖可得一條直線，如圖4A所示[6]。

由圖4A與表1可看出，S-V曲線均具有較好的線性關系(r2>0.99)，說明兩者之間只發(fā)生一種猝滅。在288、299、310 K溫度下，由直線的斜率求得HSA+LJC-116體系的KSV分別為4.320×103、3.810×103、3.540×103L·mol-1。 在3個溫度下，HSA+LJC-116體系的Kq分別為:Kq=4.324×1011L/(mol·s)，r2=0.999 0(288 K);Kq=3.814×1011L/(mol·s)，r2=0.997 5(299 K);Kq=3.542×1011L/(mol·s)，r2=0.998 9(310 K)。3個溫度下的Kq值均大于2.0×1010L/(mol·s)，此外，S-V曲線的斜率隨溫度的升高而降低，表明LJC-116在實驗濃度下對HSA的熒光猝滅效應不是動態(tài)猝滅，而是通過復合物形成[7]。 因此，LJC-116與HSA的猝滅類型是靜態(tài)猝滅。 此結果與紫外可見光譜判斷的猝滅類型一致[11]。

表1 3個溫度下HSA+LJC-116體系的KSV、Kq、KA、n、ΔG0、ΔH0和ΔS0Table 1 Quenching constants(KSV and Kq),stability constants(KA)，binding site numbers(n) and thermodynamic parameters calculated according to Stern-Volmer plots and double logarithm plots of HSA+LJC-116 system at three temperatures

2.2.2LJC-116與HSA的結合常數(shù)及結合位點數(shù)當小分子獨立結合在高分子的1組位點時,可用雙對數(shù)方程來確定結合常數(shù)和結合位點數(shù)[15]。

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]

(2)

式中,KA為LJC-116與HSA的結合常數(shù)，n為LJC-116與HSA之間的結合位點數(shù)，[Q]是游離體系中LJC-116的濃度，但由于其濃度未知，因此計算中以猝滅劑LJC-116的濃度代替。 將lg [(F0-F)/F]對lg [Q]作圖(圖4B)，所得直線斜率為結合位點數(shù)，截距的負對數(shù)值為結合常數(shù)。 因此從表1可得，在288 K時，HSA+LJC-116體系中KA=4.629×104L/mol，n=1.006 4，在299 K時，KA=4.172×104L/mol，n=1.008 2，在310 K時KA=3.808×104L/mol，n=1.006 55。 這表明，LJC-116與HSA之間相互作用的結合常數(shù)大小順序為：HSA+LJC-116(310 K)

2.2.3LJC-116與HSA的作用力類型LJC-116與HSA之間作用類型的判斷對藥物設計有著重要的指導作用?；诓煌瑴囟认碌腒A，結合以下熱力學公式，可求出結合反應過程中的焓變(ΔH)、熵變(ΔS) 和自由能變(ΔG)。

ΔG=-RTlnKA

(3)

lnKA=-ΔH/(RT)+ΔS/R

(4)

ΔG=ΔH-TΔS

(5)

由表1可知，在3種不同溫度下，ΔG0均為負值，表明結合過程是自發(fā)的。 ΔS(66.45)>0，且 ΔH(-65.82)<0。 根據(jù)熱力學參數(shù)的正負性與結合作用力的關系，可判定LJC-116與HSA的結合為疏水作用和氫鍵共同作用所致[15]。 LJC-116的分子結構中包含2個疏水的苯環(huán)以及含N原子的1個喹啉環(huán)、1個哌嗪環(huán)以及三氮唑。苯環(huán)與HSA的疏水基團易形成疏水作用，而含雜原子的哌嗪環(huán)和三氮唑與HSA易形成氫鍵作用。其中雜原子N又是氫鍵的良好受體，易與HSA形成氫鍵。

圖5 HSA的熒光光譜與LJC-116紫外吸收光譜的重疊Fig.5 Spectral overlap of fluorescence of HSA solution and absorption of LJC-116 solution [HSA]=[LJC-116]=5.0×10-6 mol/L；T=288 K

2.2.4LJC-116與HSA的結合距離LJC-116與HSA的Trp殘基之間的結合距離(r)采用能量轉移效率(E)來評價。根據(jù)F?rster偶極-偶極非輻射能量轉移理論方程，E由式(6)描述[20]：

E=1/[1+(r/R0)6]

(6)

式中，r是供體(HSA)和受體(LJC-116)之間的結合距離，R0是能量轉換率為50%時的結合距離，可通過式(7)計算[20]：

(7)

式中，K2是偶極子的空間取向因子，n是介質的折射率，J是供體(HSA)的發(fā)射光譜和受體(LJC-116)吸收光譜的重疊積分，φD是供體(HSA)在缺少受體(LJC-116)下的量子產率。在此情況下，HSA分子中K2、n、φD分別為2/3、1.336和0.118[14]。 也可通過式(8)計算J[17]：

J=∑f(λ)ε(λ)λ4δλ/σf(λ)δλ

(8)

其中，ε(λ)是LJC-116在波長λ處的摩爾吸光系數(shù)，f(λ)是HSA在波長λ處的熒光強度。通過上式，R0和r可進一步被計算。圖5展現(xiàn)了HSA溶液熒光發(fā)射光譜和LJC-116紫外-可見吸收光譜的重疊。此外，能量傳遞的效率(E)也可由方程(9)確定：

E=1-F/F0

(9)

根據(jù)公式(6)～(9)，在299 K下，計算得R0=1.28 nm，r=1.69 nm，E=15.6%，J=7.1697×10-15cm3·L/mol。0.5R0

2.2.5分子探針確定HSA與LJC-116的結合位置為確定LJC-116在HSA上的結合位點，分別以華法林和布洛芬作為SiteⅠ和SiteⅡ的熒光探針試劑，考察對HSA+LJC-116體系熒光光譜的影響。固定LJC-116與HSA的摩爾比為1∶1，使熒光探針的非特異性結合達到最小[19]。逐漸加入探針試劑，LJC-116被熒光探針取代的百分比按F2/F1×100%計算[20](F1和F2分別為HSA+LJC-116體系加入探針試劑前后的熒光強度)，以F2/F1對探針試劑和HSA的濃度比作圖。結果表明，隨著布洛芬的濃度增加，HSA+LJC-116體系的熒光強度變化不大，說明HSA與布洛芬的作用位點不同。而加入的華法林使HSA+LJC-116體系的熒光強度明顯降低，華法林可將LJC-116從HSA+LJC-116中置換出來，說明LJC-116在HSA上的作用位點與華法林一致，均為SiteⅠ。

2.3 HSA與LJC-116結合后構象的變化

2.3.1同步熒光光譜的研究本研究中，設置Δλ分別等于15、60 nm，得到分別顯示Tyr和Trp殘基特性的同步熒光光譜如圖6所示。

由圖6可知，隨著LJC-116濃度的增加，Tyr和Trp殘基的同步熒光強度均逐漸降低。LJC-116的加入使熒光發(fā)生猝滅，說明LJC-116與蛋白存在相互作用。未觀察到Tyr最大發(fā)射波長發(fā)生藍移或紅移，但Trp的最大發(fā)射波長紅移了0.4 nm，說明HSA中的Trp殘基對LJC-116更敏感，HSA與LJC-116的相互作用使Trp殘基所處的疏水環(huán)境極性增加，肽鏈的伸展程度有所增加，進而引起HSA構象發(fā)生變化[21]。在同步熒光光譜中得到的Trp紅移結果與靜態(tài)熒光光譜的紅移結果一致。

2.3.2三維熒光光譜的研究為進一步分析LJC-116與HSA結合后HSA構象的變化，分別測定了HSA和HSA+LJC-116混合溶液的三維熒光光譜(見圖7)。

由表2計算可知，加入LJC-116 后，Peak 1的峰強下降了51.9%； Peak 2的峰強下降了74.5%，且斯托克斯位移從110 nm增至120 nm，表明氨基酸殘基的微環(huán)境極性增加，疏水性減弱[22]。 此結果驗證了同步熒光光譜以及靜態(tài)熒光光譜的紅移結果。值得注意的是，加入LJC-116后的HSA瑞利散射峰明顯增強，說明生成了新的尺寸更大的復合物，增大了瑞利散射峰的強度。

表2 單純HSA和HSA+LJC-116體系的三維熒光光譜特征參數(shù)Table 2 Three-dimensional fluorescence spectral characteristic parameters of free HSA and HSA+LJC-116 systems

2.4 分子對接研究

位點競爭實驗顯示了LJC-116在HSA的結合部位為Site Ⅰ，為進一步驗證這一結果，使用分子對接技術在分子水平上模擬兩者之間的結合作用。通過研究100個對接構象的聚類情況(閾值 2.0 ?)，發(fā)現(xiàn)能量最低的聚類包含的構象數(shù)目最多，取這一聚類中結合能最低的構象作為HSA+LJC-116的結合結構，結合能為-10.44 kcal/mol。對接結果見圖8。

圖8 HSA和HSA+LJC-116相互作用的分子對接圖Fig.8 Interaction model of LJC-116 at site Ⅰ of HSA with its hydrogen bodings and hydrophobic interactions

圖8所示的對接結果表明：藥物分子與HSA在site Ⅰ的疏水腔內結合，且兩者之間存在較強的疏水作用力以及氫鍵作用。與LJC-116形成氫鍵的氨基酸殘基為Lys199、Arg257、Ala291，與LJC-116產生疏水相互作用的氨基酸殘基很多(包括Tyr150、Glu153、Phe157、Glu188、Ala191、Ser192、Lys195、Trp214、Arg222、Leu238、Leu260、Ile264、Ser287、His288、Ile290、Glu292、Lys436、Asp451和Val455)。此對接結果與熱力學實驗判斷的作用力結果相吻合。

3 結 論

本文采用熒光光譜法、紫外可見吸收光譜法、同步熒光光譜法、三維熒光光譜法以及分子對接技術全面研究了新合成的小分子c-Met激酶抑制劑LJC-116與HSA之間的相互作用。首先通過紫外光譜法和熒光光譜法考察兩者的作用機制為生成靜態(tài)復合物的靜態(tài)猝滅，并計算了結合常數(shù)與結合位點數(shù)。進而根據(jù)反應的熱力學常數(shù)得出結合的作用力為氫鍵和疏水作用。同時采用探針競爭實驗獲得了LJC-116在HSA上的結合位點為SiteⅠ，且更接近于Tyr殘基。最后利用光譜法聯(lián)合F?rster偶極-偶極非輻射能量轉移理論方程計算了兩者之間的結合距離。并采用同步熒光光譜法和三維熒光光譜法探討了HSA構象的變化。本研究為小分子c-Met激酶抑制劑分子在體內的轉運和傳輸提供了一定的信息，并進一步闡明了人血清白蛋白的結構和功能。

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