任德強，張立恒，宋新剛

（哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司，黑龍江 哈爾濱 150025）

豬細小病毒(porcine parvovirus，PPV)是引發(fā)豬細小病毒病的病原體，可引起胚胎的感染、死亡，母豬不表現(xiàn)比較明顯臨床癥狀的繁殖障礙性疾病。目前接種疫苗仍是解決本病的最好方案。為生產(chǎn)出優(yōu)質的疫苗，需要摸索PPV毒株在不同細胞系上的增殖情況，如不能掌握其規(guī)律，生產(chǎn)出足夠的抗原，將難以用于生產(chǎn)。PPV只能在豬的細胞和人的某些傳代細胞中增殖，且在不同細胞上的生物學特性也不盡相同。通過培養(yǎng)比較，獲得培養(yǎng)該病毒滴度高、病變明顯的細胞及培養(yǎng)條件，為生產(chǎn)高水平疫苗提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病 毒 PPV H株，實驗室鑒定、保管和供應，經(jīng)PK15細胞增殖，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 細 胞 ST傳代細胞購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；PK15細胞由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；豬睪丸、豬腎原代細胞取自初生健康仔豬，無菌取睪丸、腎，按常規(guī)方法消化，制備原代細胞。

1.1.3 培養(yǎng)基與胰酶 購自GIBCO公司；新生牛血清（NBCS）購自GIBCO公司；胰酶(1：250為GIBCO公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器設備 CO2培養(yǎng)箱 (HF240型)，HealForce公司；細胞培養(yǎng)瓶和96孔細胞培養(yǎng)板，美國Corning公司；倒置顯微鏡(TS100)，Nikon 公司。

1.2 方 法

1.2.1 病毒增殖 待細胞長至30%～50%單層時，棄去營養(yǎng)液，將毒種接種至試驗細胞，吸附1h，換含2%血清的維持液至病毒收獲。并同時設未接毒對照細胞，至37℃ 5%CO2培養(yǎng)。每天觀察并記錄CPE情況，當70%～80%細胞出現(xiàn)CPE時收毒，凍融3次，-70℃冰柜保存?zhèn)溆?，按此方法試?次。

1.2.2 HA測定 紅細胞按實驗室常規(guī)方法用pH7.2 PBS配成0.6%豚鼠紅細胞懸液備用。測定以上4種細胞培養(yǎng)的病毒液的血凝價。

1.2.3 TCID50測定 96孔微量培養(yǎng)板中每孔加入細胞懸液100μL，將待測病毒液分別作 10-1～10-7倍梯度稀釋，每稀釋度6孔，每孔加入不同稀釋度的病毒液 100mL，細胞對照組加100μL細胞稀釋液。置37℃ 5%CO2培養(yǎng)，逐日記錄CPE出現(xiàn)孔，觀察到120h，按Reed-Muench法計算病毒滴度。

2 結果與分析

2.1 病變情況

PPV-H株接種ST細胞后24h開始出現(xiàn)病變，細胞出現(xiàn)彌漫性顆粒，36h空斑明顯增多，48h左右，細胞出現(xiàn)空斑、拉網(wǎng)、脫落現(xiàn)象。CPE可達80%左右，而同時對照組細胞未出現(xiàn)CPE。PPV-H株接種PK15細胞后24h開始出現(xiàn)病變，細胞出現(xiàn)彌漫性顆粒，40h空斑明顯增多，60h左右，細胞出現(xiàn)拉網(wǎng)、脫落現(xiàn)象。CPE可達80%左右，而同時對照組細胞未出現(xiàn)CPE。PPV-H株接種豬睪丸、豬腎原代細胞后24h開始出現(xiàn)病變，細胞出現(xiàn)彌漫性顆粒，48h左右，細胞出現(xiàn)空斑、拉網(wǎng)、脫落現(xiàn)象。72h CPE可達80%左右，而同時對照組細胞未出現(xiàn)CPE。

2.2 病毒滴度與血凝價測定結果

結果見表1。

表1 PPV H株在不同細胞上增殖的TCID50和HA

3 討論與結論

PPV可在多種細胞上生長并導致細胞產(chǎn)生CPE。本研究采用ST、PK15、豬睪丸和豬腎原代細胞增殖該病毒，找到病毒在細胞上的病變特性和規(guī)律，確定收毒最佳時機，比較其增殖能力，對疫苗研制和生產(chǎn)起著極重要作用，為該病防控奠定基礎。

血凝試驗是病毒鑒定和血清學分析的常用手段。PPV對豚鼠紅細胞有凝集活性。決定這一特性的是PPV血凝素。PPV凝血活性間接反映其生物活性。為了全面評價不同條件下PPV活性，本研究同時測定病毒含量和其血凝效價。由于PPV增殖需要利用細胞S期的DNA聚合酶。本研究表明PPV接種最佳期是在ST細胞形成30%～50%單層時進行接種，因為這個時期的多數(shù)細胞處于細胞合成期，這時細胞多聚酶有利于病毒的復制。另外，牛血清過多會引起免疫豬的過敏反應，用異步法接毒可以降低這種影響，還會保持接毒時細胞的狀態(tài)穩(wěn)定。

本研究結果顯示，該PPV毒株在ST細胞上出現(xiàn)CPE時間較早，病毒含量和血凝價高，且比其他3種細胞上CPE出現(xiàn)的時間均較早，節(jié)省時間和培養(yǎng)成本。因此本試驗建議將ST細胞作為增殖PPV-H毒株的首選細胞，這將為疫苗大規(guī)模生產(chǎn)提供依據(jù)。

[1] 殷震，等.動物病毒學[M].第 2 版.北京：科學出版社，1997：1145-1155

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[3]朱紹輝等.豬細小病毒X株在不同細胞上增殖效果比較[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報，2012，6：6-10.