石 煒

在世界范圍內(nèi)胃癌是第二位引起癌相關性死亡的癌癥，是第四位最常見的惡性腫瘤[1]。隨著發(fā)病率的上升，胃癌已經(jīng)成為一種嚴重危害人類健康的疾病。同其他許多人類癌癥一樣，胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及眾多因素參與，包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活等。

MiRNA是一類非編碼RNA小分子，長度大約20～25個核苷酸，通過調(diào)控特異靶基因活性參與許多人類疾病的發(fā)生[2-3]。已有研究表明，異常的miRNA表達參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5]。MiR-199于2003年被首次認識，它包含兩個發(fā)夾前體，分別在1號和19號染色體上，此兩種發(fā)夾前體可被切割成兩種成熟體，即miR-199a/b-3p和miR-199a/b-5p[6-8]。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-199a/b-3p作為一種抑癌基因參與了許多人類腫瘤的發(fā)病過程，包括肝細胞癌[7]、甲狀腺乳頭狀癌[9]、子宮內(nèi)膜樣腺癌[10]、腎細胞癌[11]、骨肉瘤[12]、卵巢癌[13]和乳腺癌[14]。 目前還不清楚它是否參與胃癌的發(fā)病過程。本研究旨在探討miR-199a/b-3p在胃癌中的表達及其對胃癌細胞的增殖功能的影響。

材料與方法

一、材料

1.臨床標本

收集20對胃癌和對應的癌旁組織，提取總RNA用于MiR-199a/b-3p表達水平的檢測。MiR-199a/b-3p表達水平與臨床病理的相關性如表1所示。

表1 MiR-199a/b-3p表達水平與胃癌患者臨床病理的相關性

2.細胞系

人胃癌細胞株MGC-803（CBP60485）購自南京科佰生物科技有限公司。細胞培養(yǎng)：用含有10%胎牛血清（HyClone）的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.試劑

cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司。qPCR試劑盒購自Roche公司。抗PAK4、p-MEK、p-ERK和β-actin抗體購自Cell Signaling Technology公司。MTT和DMSO購自Sigma公司。

二、方法

1.細胞轉(zhuǎn)染

MiR-199a/b-3p mimics和陰性對照試劑（negative control,NC）購自RIBOBIO公司，PAK4-siRNA購自蘇州吉瑪公司，Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，轉(zhuǎn)染前1天在6孔板中按每孔接種約2×105個細胞，細胞匯合達70%～90%進行轉(zhuǎn)染，在一1.5 mL離心管中加250 μL無血清DMEM培養(yǎng)基，再加入100 pmol mimics或siRNA，柔和混勻，在另一1.5 mL離心管中加入250 μL無血清DMEM培養(yǎng)基，再加入5 μL Lipofectamine 2000，輕輕混勻，室溫放置5 min，然后將兩管輕輕混勻，室溫放置20 min，將混合液加到含培養(yǎng)基的孔板內(nèi)，最后將6孔板放入培養(yǎng)箱孵育，48 h后進行轉(zhuǎn)染后的其他檢測步驟。

2.實時定量PCR檢測核酸表達水平

用Takara公司的RNAiso試劑盒抽提細胞和組織的總RNA，按cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒說明書操作，分別用U6和β-actin作為miR和mRNA的內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)。實驗中用到的引物序如表2所示。

表2 實驗中用到的引物序列

3.Western blot檢測蛋白表達水平

分別選取上面轉(zhuǎn)染實驗處理的細胞，參照《分子克隆》的實驗步驟，提取總蛋白質(zhì)，40 μg總蛋白用不連續(xù)SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，麗春紅S染色，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入抗PAK4、p-MEK、p-ERK和β-actin抗體，均按1:1 000稀釋，4℃過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗孵育4 h，然后用Millipore發(fā)光液顯色。以β-actin為內(nèi)參。

4.MTT法檢測細胞增殖

分別選取前述轉(zhuǎn)染實驗處理的細胞，以5×103個/孔的細胞密度接種于96孔板中。分別在培養(yǎng)0、24、48、72 h 后， 每孔加入 MTT 溶液 （5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，吸干孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩至結(jié)晶充分溶解，選擇570 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度值。

三、統(tǒng)計方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)數(shù)進行處理。計量資料以表示，采用方差分析；計數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、MiR-199a/b-3p抑制MGC-803細胞增殖

通過分析胃癌和相應癌旁組織中MiR-199a/b-3p的表達水平，發(fā)現(xiàn)癌組織中的表達顯著減少（圖1 A）。MGC-803細胞轉(zhuǎn)染 miR-199a/b-3p mimics后，miR-199a/b-3p的表達量顯著增加，表現(xiàn)為濃度依賴性 （圖1 B）。細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-199a/b-3p mimics后，細胞的增殖活性下降 （圖1C）。

圖 1 miR-199a/b-3p抑制胃癌細胞 MGC-803增殖（*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001）

二、MiR-199a/b-3p抑制 MGC-803細胞中PAK4的表達

通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，PAK4是MiR-199a/b-3p可能的靶點調(diào)控基因（表3）。MGC-803細胞轉(zhuǎn)染miR-199a/b-3p mimics后，PAK4的mRNA和蛋白表達都顯著性減少（圖2）。

圖2 miR-199a/b-3p下調(diào)胃癌細胞MGC-803中PAK4的表達（*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01；***P ＜ 0.001）

三、MiR-199a/b-3p通過 PAK4/MEK/ERK通路抑制MGC-803細胞增殖

通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，MiR-199a/b-3p靶標基因最富集的信號通路是MAPK通路 （圖3）。MGC-803細胞轉(zhuǎn)染miR-199a/b-3p mimics后，發(fā)現(xiàn)p-MEK和p-ERK表達水平均減少。此外，MGC-803細胞轉(zhuǎn)染PAK4 siRNA后，p-MEK和p-ERK表達水平均顯著性減少和細胞的增殖活性下降（圖 4）。

表3 PAK4是MiR-199a/b-3p的靶點基因

討 論

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生和發(fā)展涉及多種癌基因的激活、抑癌基因的失活以及由此引起的細胞生物學行為的改變等[1]。miRNAs是一類長度在約20個核苷酸的非編碼小分子RNA，參與多種人類疾病的發(fā)病過程。目前已知miR-199a/b-3p作為一種抑制基因參與多種腫瘤細胞的抑制增殖作用，但在胃癌中的表達和功能還不清楚。因此，本研究的目的是檢測miR-199a/b-3p在胃癌組織中的表達水平以及它在胃癌的發(fā)病過程中起到什么樣的功能。

圖3 MAPK通路是MiR-199a/b-3p靶標基因最富集的信號通路（數(shù)據(jù)來源https://www.gcbi.com.cn）

圖4 MiR-199a/b-3p通過PAK4/MEK/ERK通路抑制MGC-803細胞增殖（**P＜0.01；***P＜0.001）

通過檢測胃癌組織中miR-199a/b-3p的表達水平，結(jié)果顯示相比對應的癌旁組織，它在胃癌組織的表達水平明顯減少（圖1A）。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-199a/b-3p minics的MGC-803細胞增殖活性顯著降低（圖1C），提示miR-199a/b-3p能抑制胃癌細胞MGC-803的增殖活性。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，PAK4是miR-199a/b-3p的靶標基因（表3），而MAPK通路是miR-199a/b-3p靶標基因最富集的信號通路（圖3）。我們接下來研究表明，miR-199a/b-3p是通過PAK4/MEK/ERK通路調(diào)控胃癌細胞MGC-803的增殖活性。MGC-803細胞轉(zhuǎn)染miR-199a/b-3p minics后，PAK4表達水平顯著性減少（圖2），而細胞轉(zhuǎn)染PAK4 siRNA后，MEK和ERK磷酸化水平顯著性減少，同時發(fā)現(xiàn)MGC-803的增殖活性也明顯降低（圖4）。這些結(jié)果提示MiR-199a/b-3p通過PAK4/MEK/ERK通路抑制MGC-803細胞增殖。

盡管我們的研究發(fā)現(xiàn)miR-199a/b-3p作為一種抑癌基因在胃癌組織中低表達，但有研究表明miR-199a/b-5p在胃癌組織中高表達，通過調(diào)控靶標基因klotho的表達行使促癌基因的功能[15-16]。通過分析miR-199a/b-3p和miR-199a/b-5p的序列結(jié)構(gòu)信息，我們發(fā)現(xiàn)兩者雖然都是miR-199a/b的成熟體，但它們的序列是不一樣的，分別是5′-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3′和 5′-ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA-3′（數(shù)據(jù)來源http://www.mirbase.org）。此外，通過分析兩者的靶基因，發(fā)現(xiàn)它們的靶點基因也不同（表4），這些結(jié)果表明雖然兩者都屬于miR-199a/b的成熟體，但是由于兩者序列不同，它們行使的功能也不同。

表4 根據(jù)PCT值排前十位的miR-199-3p/5p靶標基因

總之，我們的研究表明MiR-199a/b-3p通過下調(diào)PAK4/MEK/ERK通路對胃癌的增殖產(chǎn)生抑制作用，可作為一種新的胃癌預后生物標志物和潛在的胃癌生物學治療靶點。

[1]Yuan W,Yang N,Li X.Advances in Understanding How Heavy Metal Pollution Triggers Gastric Cancer[J].Biomed Res Int,2016,2016:7825432.

[2]Tyagi N,Arora S,Deshmukh SK,et al.Exploiting Nanotechnology for the Development of MicroRNA-Based Cancer Therapeutics[J].J Biomed Nanotechnol,2016,12(1):28-42.

[3]Gurtner A,Falcone E,Garibaldi F,et al.Dysregulation of microRNA biogenesis in cancer:the impact of mutant p53 on Drosha complex activity[J].J Exp Clin Cancer Res,2016,35:45.

[4]Iorio MV,Croce CM.microRNA involvement in human cancer[J].Carcinogenesis,2012,33(6):1126-1133.

[5]Thomas J,Ohtsuka M,Pichler M,et al.MicroRNAs:Clinical Relevance in Colorectal Cancer[J].Int J Mol Sci,2015,16(12):28063-28076.

[6]Lagos-Quintana M,Rauhut R,Meyer J,et al.New microRNAs from mouse and human[J].Rna,2003,9(2):175-179.

[7]Hou J,Lin L,Zhou W,et al.Identification of miRNomes in human liver and hepatocellular carcinoma reveals miR-199a/b-3p as therapeutic target for hepatocellular carcinoma[J].Cancer Cell,2011,19(2):232-243.

[8]Landgraf P,Rusu M,Sheridan R,et al.A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing[J].Cell,2007,129(7):1401-1414.

[9]Minna E,Romeo P,De Cecco L,et al.miR-199a-3p displays tumor suppressor functions in papillary thyroid carcinoma[J].Oncotarget,2014,5(9):2513-2528.

[10]Wu D,Huang HJ,He CN,et al.MicroRNA-199a-3p regulates endometrial cancer cell proliferation by targeting mammalian target of rapamycin(mTOR)[J].Int J Gynecol Cancer,2013,23(7):1191-1197.

[11]Tsukigi M,Bilim V,Yuuki K,et al.Re-expression of miR-199a suppresses renal cancer cell proliferation and survival by targeting GSK-3beta[J].Cancer Lett,2012,315(2):189-197.

[12]Duan Z,Choy E,Harmon D,et al.MicroRNA-199a-3p is downregulated in human osteosarcoma and regulates cell proliferation and migration[J].Mol Cancer Ther,2011,10(8):1337-1345.

[13]Wang Z,Ting Z,Li Y,et al.microRNA-199a is able to reverse cisplatin resistance in human ovarian cancer cells through the inhibition of mammalian target of rapamycin[J].Oncol Lett,2013,6(3):789-794.

[14]Li SQ,Wang ZH,Mi XG,et al.MiR-199a/b-3p suppresses migration and invasion of breast cancer cells by downregulating PAK4/MEK/ERK signaling pathway[J].IUBMB life,2015,67(10):768-777.

[15]Zhang Y,Fan KJ,Sun Q,et al.Functional screening for miRNAs targeting Smad4 identified miR-199a as a negative regulator of TGF-beta signalling pathway[J].Nucleic Acids Res,2012,40(18):9286-9297.

[16]He XJ,Ma YY,Yu S,et al.Up-regulated miR-199a-5p in gastric cancer functions as an oncogene and targets klotho[J].BMC Cancer,2014,14:218.