程 蕾，譚明夏, 2，胡修忠，向 敏，劉曉華，余 婕，周 源，王定發(fā)

(1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北 武漢 430208，2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070 )

水牛養(yǎng)殖業(yè)在我國南方分布較為廣泛，水牛雖然全年發(fā)情但存在卵泡發(fā)育不充分、發(fā)情表現(xiàn)不明顯的特征，導(dǎo)致其受胎率普遍較低[1]。母牛單次配種后盡管受精率為90%以上，但是妊娠失敗卻高達(dá)35%～50%，是導(dǎo)致產(chǎn)犢率低下的主要原因，而絕大多數(shù)妊娠失敗(70%～80%)發(fā)生在受精后的前3周，這其中又以14～19 d母體妊娠識別時期的早期胚胎丟失為主[2-3]。血液是機體內(nèi)環(huán)境的重要組成部分，血常規(guī)是最基礎(chǔ)的血液檢驗。在生產(chǎn)實踐中對血液進(jìn)行血常規(guī)分析，可以及時監(jiān)測牛群狀態(tài)并對機體是否存在感染、貧血以及血液系統(tǒng)疾病等及早診斷，從而通過提前預(yù)防治療以及繁殖管理，降低實際生產(chǎn)中可能存在的風(fēng)險[4]。目前，血細(xì)胞分析已被認(rèn)為是牛疾病的一種診斷工具[5]。因此，為了探究水牛早期胚胎損失的原因，本研究對14頭摩拉水牛進(jìn)行了同期發(fā)情和人工授精，通過采集人工授精后0 d、18 d、20 d、23 d和28 d的外周血樣本和血常規(guī)檢測，研究其血常規(guī)數(shù)據(jù)的動態(tài)變化規(guī)律。結(jié)合早期妊娠階段牛血常規(guī)數(shù)據(jù)和妊娠失敗之間的內(nèi)在關(guān)系分析，從血細(xì)胞參數(shù)變化方面對本試驗牛群妊娠失敗的原因進(jìn)行深度分析，以便于制定相應(yīng)的預(yù)防措施減少由早期妊娠失敗帶來的經(jīng)濟損失，同時也為血液方面的研究在相關(guān)動物繁殖和動物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗牛來自于湖北省鄂州市某水牛養(yǎng)殖場，選取健康狀況良好、體態(tài)相近的未孕摩拉水牛14頭，用生源2+1法(寧波市三生藥業(yè)有限公司)進(jìn)行同期發(fā)情處理，并在發(fā)情后進(jìn)行人工授精，采集人工授精后0 d、18 d、20 d、23 d和28 d的血液樣本進(jìn)行血常規(guī)分析。在人工授精后的第42 d利用直腸檢查和B超檢查進(jìn)行妊娠診斷，診斷結(jié)果顯示本次試驗牛均為空懷牛。

1.2 儀器及檢測指標(biāo)

全自動血細(xì)胞分析儀ADVIA 2120i (SIEMENS)以及配套試劑，儀器開機后按照操作規(guī)程利用血液分析儀質(zhì)控品(正常值)即3-in-1 TESTpointTM Hematology Controls(SIEMENS)首先對血液學(xué)檢測系統(tǒng)的精密度和準(zhǔn)確性進(jìn)行監(jiān)測，確保儀器工作正常后，在物種“牛(bovine)”模式下對水牛的五分類血液參數(shù)進(jìn)行檢測，檢測指標(biāo)見表1。

表1 牛全血參數(shù)指標(biāo)及其參考范圍

1.3 樣本采集、預(yù)處理和上機檢測

采集人工授精后0 d、18 d、20 d、23 d和28 d的血液樣本。采血均在上午進(jìn)行，采血前對保定牛的耳面進(jìn)行消毒處理，耳靜脈采血0.5～1 mL置于2 mL EDTA抗凝管中輕輕混勻，低溫保存并運至實驗室。利用全自動五分類血細(xì)胞分析儀分析血液中WBC(白細(xì)胞絕對值)、NEU(嗜中性粒細(xì)胞絕對值)、LYM(淋巴細(xì)胞絕對值)、RBC(紅細(xì)胞)和PLT(血小板)等血液參數(shù)。上機前所有樣本平衡至室溫，血常規(guī)檢測于采樣當(dāng)天完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析和處理

2 結(jié)果

2.1 妊娠失敗摩拉水牛白細(xì)胞變化情況

人工授精后各時間點白細(xì)胞的各項數(shù)據(jù)匯如表2所示。通過與表1對比后發(fā)現(xiàn)：人工授精后0 d和18 d白細(xì)胞參數(shù)均在正常值范圍或接近正常值。人工授精后20 d、23 d和28 d除嗜中性粒細(xì)胞絕對值(NEU)在正常值范圍，白細(xì)胞(WBC)、單核細(xì)胞絕對值(MONO)和淋巴細(xì)胞絕對值(LYM)均超出了正常值范圍。

表2 摩拉水牛白細(xì)胞參數(shù)變化

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

從表2可以看出，WBC在人工授精后呈上升的趨勢，并在20 d后顯著增加(P<0.05)；MONO在18 d和20 d極顯著增加(P<0.01)，但在之后的時間點無顯著變化，其比例在各時間點無顯著變化。NEU及其比例(NEU%)與0 d相比均顯著降低(P<0.05)。LYM及其比例(LYM%)均呈現(xiàn)出增加的趨勢，其顯著性并隨著時間點變化，由顯著(P<0.05)變?yōu)闃O顯著(P<0.01)。

2.2 妊娠失敗摩拉水牛紅細(xì)胞變化情況

人工授精后各時間點的紅細(xì)胞參數(shù)如表3所示。人工授精后0 d，各紅細(xì)胞參數(shù)均在正常值的范圍或接近于正常值。而人工授精后18 d至28 d，除血紅蛋白(HGB)和紅細(xì)胞分布寬度變異數(shù)(RDW)外，其它紅細(xì)胞參數(shù)均不在正常范圍之內(nèi)。與0 d相比，人工授精后18 d及之后的時間點，紅細(xì)胞數(shù)(RBC)和紅細(xì)胞壓積(HCT)均極顯著下降(P<0.01)；紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)和RDW均極顯著上升(P<0.01)；各時間點HGB無顯著變化。

2.3 妊娠失敗摩拉水牛血小板變化情況

從表4可看出，試驗期間平均血小板體積(MPV)無顯著變化。與人工授精后0 d相比，18 d和20 d的血小板數(shù)(PLT)顯著降低(P<0.05)，23 d和28 d血小板數(shù)目出現(xiàn)一定量的增加；18 d、23 d和28 d的血小板分布寬度(PDW)極顯著降低(P<0.01)。

表3 摩拉水牛紅細(xì)胞參數(shù)變化

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

表4 摩拉水牛血小板參數(shù)比較

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

血常規(guī)指標(biāo)是重要的、基本的生理指標(biāo)，能直接客觀地反映出疾病的變化及進(jìn)程，在牛的健康檢測、疾病診斷以及預(yù)后中的研究和應(yīng)用越來越廣泛[6-8]。本研究檢測了妊娠失敗摩拉水牛人工授精后0 d、18 d、20 d、23 d和28 d的血常規(guī)指標(biāo)，結(jié)果顯示0 d和18 d時白細(xì)胞參數(shù)均在正常值范圍或接近正常值，提示試驗牛在人工授精之前健康狀況良好。而WBC于人工授精后20 d及其之后顯著上升，并且超出正常值范圍；同時NEU顯著下降，MONO和LYM顯著上升。單核細(xì)胞因含有較多的非特異性脂酶，能吞噬異物產(chǎn)生抗體，有非特異性防御和保護(hù)作用，但牛血液中單核細(xì)胞的數(shù)量容易發(fā)生變化，故不能作為疾病的敏感指示劑[9]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，MONO比例在整個試驗過程中并沒有顯著變化，而且MONO絕對值上升的幅度很小，提示本次試驗白細(xì)胞的上升主要是由LYM的升高引起。淋巴細(xì)胞是體內(nèi)重要的免疫活性細(xì)胞，不具有吞噬功能，主要與漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體物質(zhì)，參與機體的特異性免疫反應(yīng)[10]；同時，T淋巴細(xì)胞還是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的主要組分，妊娠識別與妊娠建立期間，母體在一定程度上需要通過弱化其細(xì)胞免疫實現(xiàn)對早期發(fā)育胚胎的免疫耐受。牛暉等[7]報道指出，由細(xì)菌感染引起的子宮內(nèi)膜炎，患病奶牛NEU及其比例及顯著增加，LYM比例極顯著降低；同時也有報道指出病毒性疾病在臨床上多表現(xiàn)為LYM和其比例上升[11]。本試驗中NEU及其比例及顯著降低，LYM及其比例顯著上升，提示試驗牛人工授精之后可能存在病毒性感染。本研究中，試驗牛群平日為放養(yǎng)與圈養(yǎng)結(jié)合，以自然交配為主，日常管理方面較弱。另外，本次試驗在人工授精以及血液采集的過程中均要對牛進(jìn)行驅(qū)趕后綁定，對牛群而言其生活狀態(tài)可能因過多人為因素干擾對其造成了一定的應(yīng)激；而且本次試驗血液樣本的采集集中在5月份，江南地區(qū)此時陽光強度和日平均氣溫已經(jīng)較高，可能會存在一定的熱應(yīng)激，這一系列活動影響了水牛的生理機能，降低了其免疫能力和抵抗力，從而會導(dǎo)致病原體更易入侵，使得淋巴細(xì)胞大量增殖。

試驗牛在人工授精后各個時間點的紅細(xì)胞參數(shù)顯示，與0 d相比其它各時間點RBC和HCT均極顯著下降(P<0.01)，且均低于正常值，表明試驗牛在人工授精18 d之后存在貧血癥狀。范超等[12]的研究表明，奶水牛犢牛斷奶后紅細(xì)胞數(shù)降低，而且HGB顯著下降，提示可能由于斷奶使?fàn)倥．a(chǎn)生厭食、消化不良等反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)鐵含量降低而造成的貧血。本試驗中HGB無顯著變化，而且都在正常范圍之內(nèi)，因此可以排除是由缺鐵而引起的貧血。同時研究結(jié)果也顯示，試驗牛MCV和RDW均顯著增加，提示本試驗可能由于大細(xì)胞不均一性引起的貧血[13]。而維生素或葉酸的缺乏均可引起大細(xì)胞貧血[14]，這可能由于該試驗場水牛因主要以肉用為主而平日營養(yǎng)供給不足導(dǎo)致日糧營養(yǎng)水平低下，不能滿足其配種后的生理需求。

血小板是哺乳動物血液中的有形成分之一，是由骨髓成熟的巨核細(xì)胞胞質(zhì)裂解而來的具有生物活性的小塊胞質(zhì)，具有促進(jìn)止血和傷口愈合的作用。本次試驗中人工授精后18 d和20 d PLT顯著下降(P<0.05)，而且整個試驗期間PLT均低于正常值范圍。血小板的大量減少會導(dǎo)致凝血功能的不足，從而出現(xiàn)出血癥狀，有報道稱血小板數(shù)量減少會使母體血液凝固不良，從而導(dǎo)致母體妊娠失敗[15]。因此，這也可能是導(dǎo)致本次試驗牛妊娠失敗的原因之一。

4 結(jié)論

本研究通過對配種后妊娠失敗水牛的血常規(guī)數(shù)據(jù)檢測分析發(fā)現(xiàn)，某些關(guān)鍵血常規(guī)指標(biāo)發(fā)生了顯著變化，其中，白細(xì)胞數(shù)顯著上升主要由淋巴細(xì)胞及其比例的上升所致，暗示：試驗水牛人工授精后對早期發(fā)育胚胎未能達(dá)到一種較好免疫耐受狀態(tài)，這與牛群應(yīng)激可能存在一定的關(guān)系；另外，授精后紅細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞壓積顯著下降也說明需要進(jìn)一步改善牛群日糧供給。本研究對于通過加強平時繁殖管理提升母水牛受胎率具有積極的指導(dǎo)意義。

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