王曉?shī)?，陳?shù)林，張文華，張宏剛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

早孕因子( early pregnancy factor，EPF)是1974年由澳大利亞學(xué)者M(jìn)orton等[1]在孕鼠血清中首次發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為EPF與妊娠相關(guān)。近年來(lái)，人們逐漸證實(shí)，EPF是由受精卵及胚胎組織分泌的具有免疫抑制及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用的分泌蛋白質(zhì)[2，3]，是妊娠早期母體乳汁中最早出現(xiàn)的一種免疫抑制因子，從受精開(kāi)始到妊娠中期， EPF在人類(lèi)及家畜母體內(nèi)都會(huì)發(fā)揮作用，并出現(xiàn)生物活性的變化，在胚胎死亡或胚胎采出后24 h～48 h內(nèi)，EPF即消失。EPF可以用于預(yù)測(cè)早期胚胎死亡與流產(chǎn)、鑒定胚胎移植效果、監(jiān)測(cè)胎兒的狀態(tài)以及食道癌診斷[4，5]。

1 材料和方法

1.1 血清來(lái)源

血清樣本取自受孕4～5個(gè)月的孕牛血，經(jīng)3 000 r/ min離心后，取上清，56 ℃、30 min滅活，20 moL/L PBS A (pH 8.0) 4℃ 透析過(guò)夜。

1.2 試劑

DEAE-Sepharos F. F，CM-Sepharose F.F，Con A-Sepharose 4B，Heparin Sepharose Cl 6B均夠自Pharmacia。

1.3 EPF活性檢測(cè)[6]用玫瑰花環(huán)抑制實(shí)驗(yàn)(Ea-RIT法)

本實(shí)驗(yàn)以RIT≥8為EPF陽(yáng)性，RIT<8為EPF陰性。

1.4 早孕因子( EPE)分離與純化

其分離純化參考Mehta等[7]的方法，并加以改進(jìn)。將20 moL/L PBS A 透析24 h的孕血清加于DEAE-Sepharose F.F離子交換層析柱上，收集DE-1，置于50 moL/L乙酸銨緩沖液(pH 5.0)中4 ℃透析過(guò)夜。將透析的DE-1上樣 CM-Sepharose F.F離子交換層析，收集透過(guò)峰CM-2，0.1 moL/L醋酸鹽緩沖液(PBS B) 4℃ 透析24 h。將透析的CM-2上樣 ConA Sepharose 4B 親和層析 ，得到透過(guò)峰ConA-1，將活性峰 ConA-1濃縮后，置于含0.1 moL/L KCL，pH 7.0，0.05 moL/L Tris-HCL緩沖液(PBS C)4℃透析24 h。將透析的ConA-1上樣Heparin Sepharose CL 6B親和層析，收集HE-2 峰。將活性峰HE-2用 PEG 20000濃縮，用去離子水4℃ 透析24 h，凍干保存。

1.5 蛋白含量測(cè)定[8]用Lowry 法。

1.6 純化結(jié)果用SDS-PAGE電泳法[9]鑒定純化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 孕牛血清中 EPF 的純化結(jié)果

孕牛血清通過(guò)DEAE-Sepharose F. F離子交換層析出現(xiàn)兩個(gè)峰，經(jīng)Ea-RIT檢測(cè)DE-1有EPF活性,DE-1通過(guò)CM-Sepharose F.F離子交換層析出現(xiàn)三個(gè)峰，經(jīng)Ea-RIT檢測(cè)CM -2有EPF活性，CM-2通過(guò)ConA Sepharose 4B親和層析出現(xiàn)兩個(gè)峰，經(jīng)Ea-RIT檢測(cè)ConA-1有EPF活性。ConA-1通過(guò)Heparin Sepharose CL 6B親和層析出現(xiàn)兩個(gè)峰，經(jīng)Ea-RIT檢測(cè)HE-2有EPF活性。

2.2 孕牛血清中 EPF 蛋白含量分析

將懷孕4～5月的孕牛血清通過(guò)離子交換層析和親和層析蛋白分離純化技術(shù)后，對(duì)蛋白質(zhì)濃度、含量和回收率進(jìn)行了分析，同時(shí)采用玫瑰花環(huán)抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)收集到的蛋白質(zhì)生物活性進(jìn)行了檢測(cè)，其結(jié)果如表1所示。

表1 孕牛血清中 EPF 蛋白含量分析

2.3 SDS-PAGE電泳結(jié)果

將收集到的HE-2通過(guò)SDS-圖1：SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物

圖1 PAGE進(jìn)行分析鑒定分離純化結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)的目的是從孕牛血中分離純化EPF，為制備EPF單克隆抗體做準(zhǔn)備。將孕牛血清通過(guò)DEAE-Sepharos F. F 離子交換層析、CM-Sepharose F.F離子交換層析、ConA Sepharose 4B 親和層析、Heparin Sepharose CL 6B親和層析，所得各階段物質(zhì)采用玫瑰花環(huán)抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)[10]，結(jié)果表明第一次過(guò)DEAE-Sepharos F. F離子交換柱時(shí),不吸附在離子膠上的蛋白DE-1具有EPF活性，而吸附的蛋白DE-2沒(méi)有EPF活性；過(guò)CM-Sepharose F.F離子交換柱時(shí)，用50 moL/L乙酸銨緩沖液洗下來(lái)的蛋白CM-1沒(méi)有EPF活性，用 50 moL/L NaCl 的相同乙酸銨緩沖液洗下來(lái)的蛋白CM-2有EPF活性，而用 1 moL/L NaCl的相同乙酸銨緩沖液洗脫下來(lái)的蛋白 CM-3 也沒(méi)有EPF活性，在離子交換反應(yīng)中,EPF不吸附在DEAE-Sepharos F. F離子交換膠上，EPF而吸附CM-Sepharose F.F離子交換膠上。過(guò)ConA Sepharose 4B親和層析柱時(shí)，不能與ConA Sepharose 4B 親和的蛋白ConA-1有EPF活性，能與ConA Sepharose 4B親和的蛋白ConA-2沒(méi)有EPF活性。過(guò)Heparin Sepharose CL 6B親和層析柱時(shí)，不能與Heparin Sepharose CL 6B親和的蛋白HE-1沒(méi)有EPF活性，能與Heparin Sepharose CL 6B親和的蛋白HE-2具有EPF活性[11,12]。在親和層析過(guò)程中，由于在孕血清中存在許多種妊娠相關(guān)蛋白和激素，其中很多為糖蛋白，如α-甲胎蛋白、絨毛膜促性腺激素( HCG)、妊娠相關(guān)蛋白α-2巨球蛋白等，經(jīng)過(guò)ConA Sepharose 4B層析柱后，將這些糖蛋白[13]除去。經(jīng)過(guò)Heparin Sepharose CL 6B柱后，最后得到純化的EPF。運(yùn)用SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳檢測(cè)，可見(jiàn)蛋白條帶，相對(duì)分子量為53.6KD。目前我們通過(guò)純化早孕因子(EPF)為免疫小鼠制備早孕因子單克隆抗體，為制備出特異性強(qiáng)和純度高早孕因子單克隆抗體做準(zhǔn)備,為進(jìn)一步研制牛流產(chǎn)及不孕癥快速檢測(cè)膠體金試紙條提供條件。

參考文獻(xiàn):

[1] Morton H, Hegh V, Clunie G J A. Immunosuppression detected inpregnant mice by the rosette inhibition test [J].Nature,1974,249 (456):459.

[2] Athanasas-Platsis S,Somodevilla-Torres M J,Morton H. Investigation of the immunocompetent cells that bind early pregnancy factor and preliminary studies of the early pregnancy factor target molecule[J].Immunol Cell Biol,2004,82(4):361-9.

[3] Recombinant EPF/chaperonin 10 promotes the survival of O4-positive pro-oilgodendrocytes prepared from neonatal rat brain[J].Cell Stress Chaperones,2008,13 (4):467-74.

[4] 王曉申,魏麗軍,葉紹輝.早孕因子研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2008,19(2):313-316.

[5] Miao-Fen Chen,Kuan-Der Lee,Ming-Shian Lu. The predictive role of E2-EPF ubiquitin carrier protein in esophageal squamous cell carcinoma[J]. J Mol Med (2009) 87:307-320

[6] Mehta A R , Eessalu T E, Aggarwal B B. Purification and characterization of early pregnancy factor f rom human pregnancysera [J ]. Biol Chem,1989,264 (4) :22-66.

[7] V. Ghaffari Laleh,R. Ghaffari Laleh, N. Pirany. Measurement of EPF for detection of cow pregnancy using rosette inhibition test[J ]. Theriogenology, 2008,70(1): 105-107.

[8] 李建武.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M].第1版.北京 北京大學(xué)出版社,1994,189

[9] 夏其昌.蛋白質(zhì)化學(xué)研究技術(shù)與進(jìn)展[M].北京:科學(xué)出版社,1997:99.

[10] 張冬云,王曉華,劉樺.聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳法測(cè)定早孕因子的等電點(diǎn)[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2001,11(5):542-543.

[11] Anita R, Met ha SB,Moodbidri VP. Raghavan et.Isolationand partial characterization of early pregnancy factor (EPF) from human pregnancy serum[J]. Journal of Reproductive Immunology,1986 ,9:247-260.

[12] 陳瑞芳,黃紫蓉,豐有吉.早孕因子的研究進(jìn)展[J].中國(guó)婦幼健康研究,2007,18(5)：418-420.

[13] Kalima F,Tiemann U,Schadow D,et al.Bovine early pregnancy factor ( EPF) activity dependent on 67KD polypeptide[J ].J Reprod Immunol ,1992 (21) :57-70.