王曉姍,陳樹林,張文華,張宏剛
(西北農林科技大學 動物醫(yī)學院,陜西 楊凌 712100)
早孕因子( early pregnancy factor,EPF)是1974年由澳大利亞學者Morton等[1]在孕鼠血清中首次發(fā)現(xiàn),認為EPF與妊娠相關。近年來,人們逐漸證實,EPF是由受精卵及胚胎組織分泌的具有免疫抑制及生長調節(jié)作用的分泌蛋白質[2,3],是妊娠早期母體乳汁中最早出現(xiàn)的一種免疫抑制因子,從受精開始到妊娠中期, EPF在人類及家畜母體內都會發(fā)揮作用,并出現(xiàn)生物活性的變化,在胚胎死亡或胚胎采出后24 h~48 h內,EPF即消失。EPF可以用于預測早期胚胎死亡與流產、鑒定胚胎移植效果、監(jiān)測胎兒的狀態(tài)以及食道癌診斷[4,5]。
1.1 血清來源
血清樣本取自受孕4~5個月的孕牛血,經3 000 r/ min離心后,取上清,56 ℃、30 min滅活,20 moL/L PBS A (pH 8.0) 4℃ 透析過夜。
1.2 試劑
DEAE-Sepharos F. F,CM-Sepharose F.F,Con A-Sepharose 4B,Heparin Sepharose Cl 6B均夠自Pharmacia。
1.3 EPF活性檢測[6]用玫瑰花環(huán)抑制實驗(Ea-RIT法)
本實驗以RIT≥8為EPF陽性,RIT<8為EPF陰性。
1.4 早孕因子( EPE)分離與純化
其分離純化參考Mehta等[7]的方法,并加以改進。將20 moL/L PBS A 透析24 h的孕血清加于DEAE-Sepharose F.F離子交換層析柱上,收集DE-1,置于50 moL/L乙酸銨緩沖液(pH 5.0)中4 ℃透析過夜。將透析的DE-1上樣 CM-Sepharose F.F離子交換層析,收集透過峰CM-2,0.1 moL/L醋酸鹽緩沖液(PBS B) 4℃ 透析24 h。將透析的CM-2上樣 ConA Sepharose 4B 親和層析 ,得到透過峰ConA-1,將活性峰 ConA-1濃縮后,置于含0.1 moL/L KCL,pH 7.0,0.05 moL/L Tris-HCL緩沖液(PBS C)4℃透析24 h。將透析的ConA-1上樣Heparin Sepharose CL 6B親和層析,收集HE-2 峰。將活性峰HE-2用 PEG 20000濃縮,用去離子水4℃ 透析24 h,凍干保存。
1.5 蛋白含量測定[8]用Lowry 法。
1.6 純化結果用SDS-PAGE電泳法[9]鑒定純化結果。
2.1 孕牛血清中 EPF 的純化結果
孕牛血清通過DEAE-Sepharose F. F離子交換層析出現(xiàn)兩個峰,經Ea-RIT檢測DE-1有EPF活性,DE-1通過CM-Sepharose F.F離子交換層析出現(xiàn)三個峰,經Ea-RIT檢測CM -2有EPF活性,CM-2通過ConA Sepharose 4B親和層析出現(xiàn)兩個峰,經Ea-RIT檢測ConA-1有EPF活性。ConA-1通過Heparin Sepharose CL 6B親和層析出現(xiàn)兩個峰,經Ea-RIT檢測HE-2有EPF活性。
2.2 孕牛血清中 EPF 蛋白含量分析
將懷孕4~5月的孕牛血清通過離子交換層析和親和層析蛋白分離純化技術后,對蛋白質濃度、含量和回收率進行了分析,同時采用玫瑰花環(huán)抑制實驗對收集到的蛋白質生物活性進行了檢測,其結果如表1所示。
表1 孕牛血清中 EPF 蛋白含量分析
2.3 SDS-PAGE電泳結果
將收集到的HE-2通過SDS-圖1:SDS-PAGE鑒定純化產物
圖1 PAGE進行分析鑒定分離純化結果
本實驗的目的是從孕牛血中分離純化EPF,為制備EPF單克隆抗體做準備。將孕牛血清通過DEAE-Sepharos F. F 離子交換層析、CM-Sepharose F.F離子交換層析、ConA Sepharose 4B 親和層析、Heparin Sepharose CL 6B親和層析,所得各階段物質采用玫瑰花環(huán)抑制實驗檢測[10],結果表明第一次過DEAE-Sepharos F. F離子交換柱時,不吸附在離子膠上的蛋白DE-1具有EPF活性,而吸附的蛋白DE-2沒有EPF活性;過CM-Sepharose F.F離子交換柱時,用50 moL/L乙酸銨緩沖液洗下來的蛋白CM-1沒有EPF活性,用 50 moL/L NaCl 的相同乙酸銨緩沖液洗下來的蛋白CM-2有EPF活性,而用 1 moL/L NaCl的相同乙酸銨緩沖液洗脫下來的蛋白 CM-3 也沒有EPF活性,在離子交換反應中,EPF不吸附在DEAE-Sepharos F. F離子交換膠上,EPF而吸附CM-Sepharose F.F離子交換膠上。過ConA Sepharose 4B親和層析柱時,不能與ConA Sepharose 4B 親和的蛋白ConA-1有EPF活性,能與ConA Sepharose 4B親和的蛋白ConA-2沒有EPF活性。過Heparin Sepharose CL 6B親和層析柱時,不能與Heparin Sepharose CL 6B親和的蛋白HE-1沒有EPF活性,能與Heparin Sepharose CL 6B親和的蛋白HE-2具有EPF活性[11,12]。在親和層析過程中,由于在孕血清中存在許多種妊娠相關蛋白和激素,其中很多為糖蛋白,如α-甲胎蛋白、絨毛膜促性腺激素( HCG)、妊娠相關蛋白α-2巨球蛋白等,經過ConA Sepharose 4B層析柱后,將這些糖蛋白[13]除去。經過Heparin Sepharose CL 6B柱后,最后得到純化的EPF。運用SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳檢測,可見蛋白條帶,相對分子量為53.6KD。目前我們通過純化早孕因子(EPF)為免疫小鼠制備早孕因子單克隆抗體,為制備出特異性強和純度高早孕因子單克隆抗體做準備,為進一步研制牛流產及不孕癥快速檢測膠體金試紙條提供條件。
參考文獻:
[1] Morton H, Hegh V, Clunie G J A. Immunosuppression detected inpregnant mice by the rosette inhibition test [J].Nature,1974,249 (456):459.
[2] Athanasas-Platsis S,Somodevilla-Torres M J,Morton H. Investigation of the immunocompetent cells that bind early pregnancy factor and preliminary studies of the early pregnancy factor target molecule[J].Immunol Cell Biol,2004,82(4):361-9.
[3] Recombinant EPF/chaperonin 10 promotes the survival of O4-positive pro-oilgodendrocytes prepared from neonatal rat brain[J].Cell Stress Chaperones,2008,13 (4):467-74.
[4] 王曉申,魏麗軍,葉紹輝.早孕因子研究進展[J].生物技術通訊,2008,19(2):313-316.
[5] Miao-Fen Chen,Kuan-Der Lee,Ming-Shian Lu. The predictive role of E2-EPF ubiquitin carrier protein in esophageal squamous cell carcinoma[J]. J Mol Med (2009) 87:307-320
[6] Mehta A R , Eessalu T E, Aggarwal B B. Purification and characterization of early pregnancy factor f rom human pregnancysera [J ]. Biol Chem,1989,264 (4) :22-66.
[7] V. Ghaffari Laleh,R. Ghaffari Laleh, N. Pirany. Measurement of EPF for detection of cow pregnancy using rosette inhibition test[J ]. Theriogenology, 2008,70(1): 105-107.
[8] 李建武.生物化學實驗原理和方法[M].第1版.北京 北京大學出版社,1994,189
[9] 夏其昌.蛋白質化學研究技術與進展[M].北京:科學出版社,1997:99.
[10] 張冬云,王曉華,劉樺.聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳法測定早孕因子的等電點[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2001,11(5):542-543.
[11] Anita R, Met ha SB,Moodbidri VP. Raghavan et.Isolationand partial characterization of early pregnancy factor (EPF) from human pregnancy serum[J]. Journal of Reproductive Immunology,1986 ,9:247-260.
[12] 陳瑞芳,黃紫蓉,豐有吉.早孕因子的研究進展[J].中國婦幼健康研究,2007,18(5):418-420.
[13] Kalima F,Tiemann U,Schadow D,et al.Bovine early pregnancy factor ( EPF) activity dependent on 67KD polypeptide[J ].J Reprod Immunol ,1992 (21) :57-70.