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        孕牛血清中早孕因子的分離純化與鑒定

        2018-05-10 00:44:07王曉姍陳樹林張文華張宏剛
        中國牛業(yè)科學(xué) 2018年2期
        關(guān)鍵詞:乙酸銨層析緩沖液

        王曉姍,陳樹林,張文華,張宏剛

        (西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

        早孕因子( early pregnancy factor,EPF)是1974年由澳大利亞學(xué)者M(jìn)orton等[1]在孕鼠血清中首次發(fā)現(xiàn),認(rèn)為EPF與妊娠相關(guān)。近年來,人們逐漸證實(shí),EPF是由受精卵及胚胎組織分泌的具有免疫抑制及生長調(diào)節(jié)作用的分泌蛋白質(zhì)[2,3],是妊娠早期母體乳汁中最早出現(xiàn)的一種免疫抑制因子,從受精開始到妊娠中期, EPF在人類及家畜母體內(nèi)都會(huì)發(fā)揮作用,并出現(xiàn)生物活性的變化,在胚胎死亡或胚胎采出后24 h~48 h內(nèi),EPF即消失。EPF可以用于預(yù)測早期胚胎死亡與流產(chǎn)、鑒定胚胎移植效果、監(jiān)測胎兒的狀態(tài)以及食道癌診斷[4,5]。

        1 材料和方法

        1.1 血清來源

        血清樣本取自受孕4~5個(gè)月的孕牛血,經(jīng)3 000 r/ min離心后,取上清,56 ℃、30 min滅活,20 moL/L PBS A (pH 8.0) 4℃ 透析過夜。

        1.2 試劑

        DEAE-Sepharos F. F,CM-Sepharose F.F,Con A-Sepharose 4B,Heparin Sepharose Cl 6B均夠自Pharmacia。

        1.3 EPF活性檢測[6]用玫瑰花環(huán)抑制實(shí)驗(yàn)(Ea-RIT法)

        本實(shí)驗(yàn)以RIT≥8為EPF陽性,RIT<8為EPF陰性。

        1.4 早孕因子( EPE)分離與純化

        其分離純化參考Mehta等[7]的方法,并加以改進(jìn)。將20 moL/L PBS A 透析24 h的孕血清加于DEAE-Sepharose F.F離子交換層析柱上,收集DE-1,置于50 moL/L乙酸銨緩沖液(pH 5.0)中4 ℃透析過夜。將透析的DE-1上樣 CM-Sepharose F.F離子交換層析,收集透過峰CM-2,0.1 moL/L醋酸鹽緩沖液(PBS B) 4℃ 透析24 h。將透析的CM-2上樣 ConA Sepharose 4B 親和層析 ,得到透過峰ConA-1,將活性峰 ConA-1濃縮后,置于含0.1 moL/L KCL,pH 7.0,0.05 moL/L Tris-HCL緩沖液(PBS C)4℃透析24 h。將透析的ConA-1上樣Heparin Sepharose CL 6B親和層析,收集HE-2 峰。將活性峰HE-2用 PEG 20000濃縮,用去離子水4℃ 透析24 h,凍干保存。

        1.5 蛋白含量測定[8]用Lowry 法。

        1.6 純化結(jié)果用SDS-PAGE電泳法[9]鑒定純化結(jié)果。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 孕牛血清中 EPF 的純化結(jié)果

        孕牛血清通過DEAE-Sepharose F. F離子交換層析出現(xiàn)兩個(gè)峰,經(jīng)Ea-RIT檢測DE-1有EPF活性,DE-1通過CM-Sepharose F.F離子交換層析出現(xiàn)三個(gè)峰,經(jīng)Ea-RIT檢測CM -2有EPF活性,CM-2通過ConA Sepharose 4B親和層析出現(xiàn)兩個(gè)峰,經(jīng)Ea-RIT檢測ConA-1有EPF活性。ConA-1通過Heparin Sepharose CL 6B親和層析出現(xiàn)兩個(gè)峰,經(jīng)Ea-RIT檢測HE-2有EPF活性。

        2.2 孕牛血清中 EPF 蛋白含量分析

        將懷孕4~5月的孕牛血清通過離子交換層析和親和層析蛋白分離純化技術(shù)后,對(duì)蛋白質(zhì)濃度、含量和回收率進(jìn)行了分析,同時(shí)采用玫瑰花環(huán)抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)收集到的蛋白質(zhì)生物活性進(jìn)行了檢測,其結(jié)果如表1所示。

        表1 孕牛血清中 EPF 蛋白含量分析

        2.3 SDS-PAGE電泳結(jié)果

        將收集到的HE-2通過SDS-圖1:SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物

        圖1 PAGE進(jìn)行分析鑒定分離純化結(jié)果

        3 討論

        本實(shí)驗(yàn)的目的是從孕牛血中分離純化EPF,為制備EPF單克隆抗體做準(zhǔn)備。將孕牛血清通過DEAE-Sepharos F. F 離子交換層析、CM-Sepharose F.F離子交換層析、ConA Sepharose 4B 親和層析、Heparin Sepharose CL 6B親和層析,所得各階段物質(zhì)采用玫瑰花環(huán)抑制實(shí)驗(yàn)檢測[10],結(jié)果表明第一次過DEAE-Sepharos F. F離子交換柱時(shí),不吸附在離子膠上的蛋白DE-1具有EPF活性,而吸附的蛋白DE-2沒有EPF活性;過CM-Sepharose F.F離子交換柱時(shí),用50 moL/L乙酸銨緩沖液洗下來的蛋白CM-1沒有EPF活性,用 50 moL/L NaCl 的相同乙酸銨緩沖液洗下來的蛋白CM-2有EPF活性,而用 1 moL/L NaCl的相同乙酸銨緩沖液洗脫下來的蛋白 CM-3 也沒有EPF活性,在離子交換反應(yīng)中,EPF不吸附在DEAE-Sepharos F. F離子交換膠上,EPF而吸附CM-Sepharose F.F離子交換膠上。過ConA Sepharose 4B親和層析柱時(shí),不能與ConA Sepharose 4B 親和的蛋白ConA-1有EPF活性,能與ConA Sepharose 4B親和的蛋白ConA-2沒有EPF活性。過Heparin Sepharose CL 6B親和層析柱時(shí),不能與Heparin Sepharose CL 6B親和的蛋白HE-1沒有EPF活性,能與Heparin Sepharose CL 6B親和的蛋白HE-2具有EPF活性[11,12]。在親和層析過程中,由于在孕血清中存在許多種妊娠相關(guān)蛋白和激素,其中很多為糖蛋白,如α-甲胎蛋白、絨毛膜促性腺激素( HCG)、妊娠相關(guān)蛋白α-2巨球蛋白等,經(jīng)過ConA Sepharose 4B層析柱后,將這些糖蛋白[13]除去。經(jīng)過Heparin Sepharose CL 6B柱后,最后得到純化的EPF。運(yùn)用SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳檢測,可見蛋白條帶,相對(duì)分子量為53.6KD。目前我們通過純化早孕因子(EPF)為免疫小鼠制備早孕因子單克隆抗體,為制備出特異性強(qiáng)和純度高早孕因子單克隆抗體做準(zhǔn)備,為進(jìn)一步研制牛流產(chǎn)及不孕癥快速檢測膠體金試紙條提供條件。

        參考文獻(xiàn):

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