孫 婷，夏小婷，黨瑞華，藍賢勇，黃永震，陳 宏，雷初朝

(西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

中國黃牛的品種數(shù)量多且分布范圍廣泛，是世界牛屬遺傳資源的重要組成部分。目前，我國有53個地方黃牛品種[1]。按地理分布區(qū)域的不同，將中國黃牛分為北方黃牛、中原黃牛和南方黃牛三大類[2]。吉安牛屬于南方黃牛，是一個役肉兼用型優(yōu)良地方品種，主要分布江西省吉安市[1]。吉安牛的選育歷史悠久，南宋詩人楊萬里著詩曰“黃牛黃蹄白雙角，牧童緣蓑笠青篛”，表明至少在12世紀就已經(jīng)有了吉安牛。

哺乳動物線粒體DNA(mtDNA)是一個雙鏈閉合的環(huán)狀DNA分子，具有結構簡單、遵循母系遺傳、無重組、進化速度快等特點，在動物的系統(tǒng)發(fā)育、演化及遺傳多樣性方面得到廣泛應用[3]。和其他哺乳動物一樣，牛的mtDNA由37個蛋白編碼基因和一段910 bp的控制區(qū)(D-loop區(qū))組成。mtDNA D-loop 區(qū)是線粒體基因組中序列和長度變異最大的區(qū)域，替換和片段的插入或缺失經(jīng)常發(fā)生，檢測這一區(qū)域的DNA變異，可以獲得較高的核甘酸變異信息，對于種間、亞種間的系統(tǒng)進化很有研究價值[4]。Lai等[5]通過對84頭中國黃牛mtDNA D-loop區(qū)的研究表明中國黃?？梢苑譃槠胀ㄅ：土雠纱髞碓矗伊雠χ袊戏脚５挠绊懜?。Lei等[6]對中國黃牛mtDNA D-loop全序列的研究也表明中國黃牛是瘤牛與普通牛的混合母系起源。

本研究對吉安牛的mtDNA D-loop全序列進行測定，分析吉安牛的遺傳多樣性及母系起源，為吉安牛的保種與利用提供遺傳基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集18頭吉安牛耳組織樣，用75%酒精保存，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。從GenBank上下載了8條吉安牛線粒體DNA D-loop全序列，其登錄號為：DQ166117、DQ344933-DQ344937，并且分別下載了一條印度瘤牛序列(L27733)和一條德國普通牛序列(AF492351)作為對照。

1.2 基因組DNA提取及PCR擴增測序

采用酚-氯仿法提取基因組DNA。采用雷初朝等[7]設計的引物擴增線粒體DNA D-loop全序列，正鏈引物和反鏈引物分別為：F：5′-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3′; R：5′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′。PCR反應體系總體積為20 μL，擴增程序為：95℃預變性4 min；94℃變性30 s，59℃退火60 s，72℃延伸90 s，共40個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將符合測序要求的PCR產(chǎn)物送至西安擎科澤西生物科技有限責任公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析方法

利用DNASTAR軟件包中的SeqMan程序對序列進行人工校對，確保所測序列的準確性。用DNASP 5.0計算單倍型多樣度、核苷酸多樣度、用分子進化遺傳分析軟件MEGA5.0構建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 吉安牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性

本研究分析了26頭吉安牛的mtDNA D-loop全序列，其長度在909-912 bp之間，其中，有2個是909 bp，有9個是910 bp，有23個是911 bp，有1個是912bp。mtDNA D-loop區(qū)的長度變化主要是由于存在插入缺失而導致的。吉安牛的mtDNA D-loop全序列由A、T、C、G四種堿基組成，其中A堿基含量最高(33.20%)，其次為T(28.00%)和C(25.30%)，G堿基含量最低，僅為13.40%。A+T的平均含量為61.20%，G+C的平均含量為38.80%，A+T的平均含量明顯高于G+C，表現(xiàn)出堿基的偏好性。

對26條吉安牛mtDNA D-loop全序列進行比對，共檢測到52個變異位點(見圖1)，按信息位點類型分，單態(tài)突變位點10個，簡約信息位點42 個；按突變類型分，包括51個轉換，1個顛換。這52個變異位點定義了7種單倍型(H1-H7)，其平均單倍型多樣度(Hd)為0.5720，平均核苷酸多樣度(Pi)為0.0113，平均核苷酸差異(k)為10.2980。

圖1 26頭吉安牛個體 mtDNA D-loop 區(qū) 7個單倍型的多態(tài)位點 “.”代表與第一條序列相同。

2.2 吉安牛NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

利用MEGA5.0軟件對吉安牛進行系統(tǒng)發(fā)育分析，以印度瘤牛(L27733)和德國普通牛(AF492351)作為參考序列，構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2可以看出，26頭吉安牛被分為瘤牛和普通牛兩大支系，說明吉安牛是瘤牛與普通牛的混合母系起源。在這26頭牛中，普通牛有2個單倍型(H3與H6)，占3個個體(Pi為0.0026)，瘤牛有5個單倍型(H1、H2、H4、H5、H7)，占23個個體(Pi為0.0066)。

圖2 吉安牛7個mtDNA D-loop單倍型構建的NJ系統(tǒng)樹

3 討論

本研究共檢測到52個變異位點，包括51個轉換，1個顛換，轉換/顛換比為51，大于轉換/顛換的臨界值2.0，之前的相關研究也表現(xiàn)出相似的規(guī)律，這主要是由于mtDNA堿基置換以轉換為主[8]。單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi)是衡量一個群體 mtDNA 變異程度的重要指標，單倍型多樣度和核苷酸多樣度的值越大，說明群體的遺傳多樣性越豐富，反之，則說明群體的遺傳多樣性越缺乏。本研究結果表明，這26頭吉安牛的mtDNA D-loop區(qū)的單倍型多樣度(Hd)為0.5720，平均核苷酸多樣度(Pi)為0.0113，表現(xiàn)出較為豐富的遺傳多樣性。構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹將吉安牛分為瘤牛和普通牛兩大支系，在26頭吉安牛個體中，有3頭牛為普通牛，其平均核苷酸多樣度(Pi)為0.0026；有23頭牛為瘤牛，其平均核苷酸多樣度(Pi)為0.0066，瘤牛的遺傳多樣性高于普通牛。23個瘤牛起源的個體(占76.92%)共享5個單倍型，3個普通牛起源的個體(占11.54%)共享2個單倍型，表明吉安牛受瘤牛的影響更大。Lai等[5]、周艷等[8]、趙曉誠等[9]、孫婷等[10]、姚一博等[11]、賈媛等[12]的研究結果也表明中國南方黃牛受瘤牛的影響更大。

總之，本研究結果表明，吉安牛mtDNA D-loop區(qū)的遺傳多樣性比較豐富，具有普通牛和瘤牛兩大母系起源，且受瘤牛的影響更大。

參考文獻:

[1] 國家畜禽遺傳資源委員會. 中國畜禽遺傳資源志—牛志[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2011.

[2] 《中國牛品種種志》編寫組. 中國牛品種志[M]. 上海：上?？茖W技術出版社, 1988.

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[4] Anderson S, de Bruijn MH, Coulson AR, et al. Complete sequence of bovine mitochondrial DNA. Conserved features of the mammalian mitochondrial genome[J]. Journal of Molecular Biology, 1982, 156(4): 683-717.

[5] Lai SJ, Liu YP, Liu YX, et al. Genetic diversity and origin of Chinese cattle revealed by mtDNA D-loop sequence variation[J]. Molecular Phylogenetics & Evolution, 2006, 38(1): 146-154.

[6] Lei CZ, Chen H, Zhang HC, et al. Origin and phylogeographical structure of Chinese cattle[J]. Animal Genetics, 2006, 37(6): 579-582.

[7] 雷初朝, 陳宏, 楊公社, 等. 中國部分黃牛品種mtDNA遺傳多態(tài)性研究[J]. 遺傳學報, 2004, 31(1): 57-62.

[8] 周艷, 陳宏, 賈善剛, 等. 中國南方部分黃牛品種mtDNA D-loop區(qū)的遺傳變異與分類分析[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版), 2008, 36(5): 7-11.

[9] 趙曉誠，黨瑞華，黃永震，等. 嶺南牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性研究[J]. 中國牛業(yè)科學，2017,43(2)：1-3.

[10] 孫婷，黨瑞華，黃永震，等. 黃陂牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性研究[J]. 中國牛業(yè)科學，2017,43(3)：1-3.

[11] 姚一博，賈媛，夏小婷，等. 湘西黃牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性研究[J]. 中國牛業(yè)科學，2017,43(5)：11-13.

[12] 賈媛，趙明，熊雄，等. 夷陵黃牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性研究[J]. 中國牛業(yè)科學，2017,43(1)：4-7.