劉 歡，白 拖，曹婉婷，徐夢(mèng)妮，黃 婷*

（1.西安石油大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710065；2.安康學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，陜西 安康 725000）

鉛難以被微生物自然降解，微量的鉛會(huì)隨著食物鏈慢慢在人體及動(dòng)物體內(nèi)累積，當(dāng)鉛累積至一定量時(shí)，便會(huì)對(duì)人體的九大系統(tǒng)造成一定程度的損害。當(dāng)前，鉛污染已對(duì)人類(lèi)生存環(huán)境造成了嚴(yán)重的威脅，所以，控制鉛污染是十分必要的。目前，檢測(cè)鉛含量的方法如光譜、質(zhì)譜、色譜和電化學(xué)分析法已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)[1-4]，這些方法雖然檢測(cè)靈敏度高、選擇性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，但大多依賴(lài)大型儀器設(shè)備、耗時(shí)、費(fèi)用高、不便攜帶，并需要訓(xùn)練有素的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行預(yù)處理，不利于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)鉛含量。因此，人們對(duì)研究一個(gè)具有高靈敏度、高選擇性、低費(fèi)用、能實(shí)時(shí)分析，以及需要少量的樣品預(yù)處理就可以檢測(cè)鉛的方法充滿(mǎn)興趣。

研究表明，脫氧核酶DNA分子對(duì)許多特定的化學(xué)反應(yīng)具有高催化活性。1994年首次報(bào)道“8-17”脫氧核酶對(duì)鉛具有高特異性[5]，反應(yīng)機(jī)理主要是當(dāng)出現(xiàn)Pb2+時(shí)，酶鏈將底物鏈剪切成兩段[6-8]。同時(shí)，基于“8-17”脫氧核酶檢測(cè)Pb2+的各種生物傳感器已經(jīng)被設(shè)計(jì)出來(lái)，其檢出限范圍是皮摩爾水平到微摩爾的水平[9-10]。然而，大多數(shù)生物傳感器因其操作的復(fù)雜性不適合現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試，陸和[11]研究出一個(gè)方便又實(shí)用的涂有“8-17”脫氧核酶和納米金的試紙來(lái)檢測(cè)Pb2+，檢出限為0.5μmol/L，但是，它在一些特定條件下不夠敏感，不能滿(mǎn)足檢測(cè)需求。因此，仍然需要進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)以獲得較低的檢出限。

Mirkin等人首次提出生物條形碼檢測(cè)技術(shù)[10]，主要基于功能化納米金與特定的探針，可以識(shí)別具體目標(biāo)分析物和大量的寡核苷酸鏈。這些作為代理靶標(biāo)具有相同序列的寡核苷酸鏈被稱(chēng)為條形碼，它們很容易被其相應(yīng)識(shí)別代理捕獲，從而有效地增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度[12-13]。同時(shí)，大量條形碼的存在可以大大降低了特定探針的使用。通過(guò)使用生物條形碼檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)DNA，使其檢測(cè)靈敏度達(dá)到納摩爾級(jí)，并具有選擇性高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、簡(jiǎn)單和成本低的優(yōu)點(diǎn)，可以對(duì)Pb2+現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[14]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

鏈酶親和素（SA），上海生物源葉有限公司；塑料粘合底板、NC（硝酸纖維）膜、結(jié)合墊、吸水墊、樣品墊，上海杰一生物有限公司；鉛（Pb(NO3)2），天津化學(xué)試劑廠；17E酶鏈、17DS地物分解鏈、條形碼DNA、捕獲DNA，生工生物工程（上海）有限公司；牛血清蛋白（BSA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、磷酸鹽緩沖液 （PBS）、鹽酸胍 （Gu-HCl）、琥珀4-（N-馬來(lái)酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸（SMCC），Sigma-Aldrich公司；納米金 （AuNPs），南京吉倉(cāng)納米材料有限公司。

鉛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制（100 nmol/L）：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.0033g硝酸鉛（分析純），加入少量水溶解，定容于100 mL容量瓶中，得到濃度為100nmol/L的鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別配置濃度為50 nmol/L、20 nmol/L、10 nmol/L、5 nmol/L、0 nmol/L的鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液。

將1mg鏈霉親和素溶解于1mL水中，得到濃度為1mg/mL的鏈霉親和素溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試紙條組成材料的選擇

1.2.1.1 樣品墊的選擇。樣品墊的作用：（1）吸收樣品，可使樣品均勻混合并遷移到結(jié)合墊和NC膜；（2）以防檢測(cè)時(shí)測(cè)試樣品浸漬超重；（3）過(guò)濾樣品中的顆粒物、懸浮物、有色雜質(zhì)等；（4）可被化學(xué)物質(zhì)浸潤(rùn)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的功能化改性。選擇樣品墊時(shí)，應(yīng)注意樣品墊不能與所測(cè)試的材料發(fā)生任何反應(yīng)，所以樣品墊通常由對(duì)水有大的親和能力的惰性材料制成。本實(shí)驗(yàn)選用GL-b01樣品墊。

1.2.1.2 結(jié)合墊的選擇。結(jié)合墊材料需滿(mǎn)足以下條件：（1）對(duì)水有大的親和能力，可以吸收納米金探針，在其有效的質(zhì)量保證期內(nèi)，當(dāng)樣品通過(guò)結(jié)合墊時(shí)，使納米金探針獲得有效釋放。結(jié)合墊應(yīng)該完全可逆吸附或者釋放納米金探針；（2）流動(dòng)性好，確保樣本可以均勻地遷移到NC膜；（3）不允許與樣品反應(yīng)，也不能與任何測(cè)試對(duì)象發(fā)生反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)選用Ahlatrom 9864金墊。

1.2.1.3 反應(yīng)膜的選擇。反應(yīng)膜須具以下特性：（1）高蛋白吸附功能使得測(cè)試線順利形成；（2）非特異性結(jié)合盡量達(dá)到最小，以便讀取測(cè)試結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)選用NC膜作為反應(yīng)膜材料。

1.2.1.4 吸收墊的選擇。測(cè)試條的尾端就是吸收墊，它的作用是吸收反應(yīng)膜上過(guò)剩的樣品。添加吸收墊后，樣品可流動(dòng)到反應(yīng)膜末端，從而對(duì)其進(jìn)行分析。選用合適的材料充當(dāng)吸收墊至關(guān)重要，應(yīng)選擇吸水性好且吸水容量大的親水性材料充當(dāng)吸收墊。本實(shí)驗(yàn)選用H-5072吸收墊。

1.2.2 測(cè)試條的制備

將25mm長(zhǎng)的硝酸纖維（NC）膜貼在塑料粘合底板上，再將15mm長(zhǎng)的吸收墊放在一邊，長(zhǎng)約15mm的結(jié)合墊放在另一邊，最后，將長(zhǎng)約15mm的樣品墊粘貼在結(jié)合墊上面。所有的搭接接口有2mm的重疊，測(cè)試條的寬度為4mm。將濃度為1mg/mL的鏈霉親和素和濃度為100μ mol/L的捕獲DNA-BSA軛合物分別涂在控制區(qū)域（線C）和測(cè)試區(qū)域（檢測(cè)線T），將納米金結(jié)合物涂在結(jié)合墊上。然后在37℃的溫度下，干燥測(cè)試條4小時(shí)，再將其保存在干燥器中。

圖1 測(cè)試條結(jié)構(gòu)圖

1.2.3 測(cè)試條的檢測(cè)原理

在纖維膜上將涂入的已知抗體或者抗原包裹，待測(cè)試樣品加入后，樣品中的抗原或者抗體在纖維膜的毛細(xì)作用下遷移，與纖維膜上的抗體或者抗原發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而與納米金標(biāo)記物發(fā)生反應(yīng)，形成檢測(cè)紅線，達(dá)到了檢測(cè)目的。

1.2.4 鉛的測(cè)定方法

將測(cè)試條的樣品墊浸入樣品溶液中約2 min，直到液體已經(jīng)遷移到硝酸纖維（NC）膜并且完全水化結(jié)合墊，然后將測(cè)試條立即水平放置讓其繼續(xù)流動(dòng)。約6 min后，可以直觀地看到測(cè)試結(jié)果。即不含鉛Pb2+的樣品中，只在控制區(qū)觀測(cè)到紅色線；含Pb2+的樣品中，控制區(qū)和測(cè)試區(qū)均出現(xiàn)紅色線。

1.2.5 樣品處理

取樣檢測(cè)漢江水，用孔徑為0.45μm的纖維素膜過(guò)濾，將某濃度的鉛標(biāo)準(zhǔn)液添加到水試樣里，調(diào)節(jié)pH值=7，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)結(jié)果和機(jī)理

圖2為鉛離子測(cè)試條的結(jié)構(gòu)及測(cè)量原理示意圖。如圖2 A所示，在結(jié)合墊上發(fā)現(xiàn)金納米共軛物?！?7DS-17E”雙鏈，就是“8-17”脫氧核酶，它包含一條酶鏈17E和一條分裂底物鏈17DS，對(duì)Pb2+有特異性。“17DS-17E”的雙鏈都是DNA，腺嘌呤核糖核苷作為底物鏈17DS的一個(gè)分裂點(diǎn)。當(dāng)Pb2+存在時(shí)，酶鏈17E在底物鏈17DS腺嘌呤核糖核苷處催化水解17DS，使17DS分裂為兩個(gè)片段。

在不考慮信息素的跡濃度揮發(fā)的理想狀態(tài)下，信息素的跡濃度增加和有效信息增加計(jì)算方式見(jiàn)表1，其中I表示螞蟻發(fā)現(xiàn)一處食物源并有效反饋的信息數(shù)值．

測(cè)試結(jié)果表明，當(dāng)Pb2+不存在時(shí)，金納米結(jié)合物不分裂，并且遷移至硝酸纖維膜，直至控制區(qū)。在控制區(qū)，經(jīng)過(guò)特定的鏈霉親和素與生物素相互作用產(chǎn)生的鏈霉親和素可以捕獲生物素化的軛合物，從而產(chǎn)生一個(gè)控制線（如圖2 B）。當(dāng)Pb2+存在時(shí)，17E酶鏈催化底物鏈17DS使其在腺嘌呤核糖核苷處裂開(kāi)。因此，金納米結(jié)合物被分裂成三個(gè)部分：含生物素的DNA片段、17E酶鏈、含有條形碼DNA和殘留17DS的納米金結(jié)合物。被分裂的納米金結(jié)合物將遷移越過(guò)控制區(qū)直到測(cè)試區(qū)，條形碼DNA和互補(bǔ)的捕獲DNA雜化，從而在測(cè)試區(qū)形成紅色線。當(dāng)然，未分裂的納米金結(jié)合物將被鏈霉親和素在控制區(qū)域捕獲。因此，控制區(qū)紅色線仍可觀測(cè)到。也就是說(shuō)，兩個(gè)區(qū)域的觀測(cè)線均變紅，（如圖2 C），則表示Pb2+存在。

圖2 測(cè)試條的結(jié)構(gòu)及測(cè)量原理示意圖

2.2 靈敏度

本實(shí)驗(yàn)分別用0、5、10、20、50、100 nmol/L一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的Pb2+溶液，檢測(cè)測(cè)試條的敏感性，測(cè)試結(jié)果如圖3所示。當(dāng)顯色只出現(xiàn)在硝酸纖維膜的控制區(qū)時(shí)，Pb2+溶液濃度低于10 nmol/L；顯色同時(shí)出現(xiàn)在硝酸纖維膜的控制區(qū)和測(cè)試區(qū)時(shí)，表明Pb2+濃度高于檢測(cè)極限，測(cè)試結(jié)果視為正常。因此10 nmol/L被認(rèn)為是探測(cè)極限。

圖3 試紙的靈敏度分析

2.3 選擇性

為研究測(cè)試條的選擇性，對(duì)濃度均為0.1 mmol/L的其他二價(jià)金屬離 子 Hg2+、Cu2+、Ni2+、Mn2+、Cd2+、Fe2+溶液，以及濃度為10 mmol/L的Mg2+、Ca2+溶液，用測(cè)試條逐個(gè)分析。結(jié)果如圖4所示，硝酸纖維膜上只出現(xiàn)一個(gè)紅色的控制線，說(shuō)明這些離子對(duì)試紙條的檢測(cè)不會(huì)造成干擾。

圖4 干擾金屬的測(cè)定

2.4 穩(wěn)定性

將測(cè)試條長(zhǎng)期儲(chǔ)存在密封鋁袋中。在儲(chǔ)存期間，每月用10組測(cè)試條對(duì)Pb2+溶液和無(wú)Pb2+溶液進(jìn)行測(cè)試，并統(tǒng)計(jì)分析這些測(cè)試條。結(jié)果顯示，測(cè)試條在三個(gè)月內(nèi)均沒(méi)有失去活性和顏色強(qiáng)度，表明測(cè)試條足夠穩(wěn)定。

2.5 樣品分析

為了驗(yàn)證測(cè)試條的有效性，采用加標(biāo)法，配制不同濃度梯度的Pb2+加標(biāo)漢江水溶液作為樣品，濃度分別為0、5、10、20、50、100 nmol/L，用測(cè)試條檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下頁(yè)表1所示，Pb2+溶液濃度為0、5 nmol/L時(shí)，僅控制區(qū)出線紅色線，檢測(cè)線未有色；而當(dāng)Pb2+溶液濃度為10、20、50、100 nmol/L時(shí)，檢測(cè)線和控制線均出現(xiàn)紅色線。實(shí)驗(yàn)所測(cè)結(jié)果與對(duì)比結(jié)果一致，因而此測(cè)試條對(duì)Pb2+的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可信。

表1 試紙條檢測(cè)加標(biāo)實(shí)際水樣結(jié)果（n=5）

3 結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試研究，成功開(kāi)發(fā)出基于脫氧核酶和條形碼DNA的功能化納米金目視檢測(cè)Pb2+的測(cè)試條。此方法檢測(cè)Pb2+靈敏度高，由于DNA條形碼的檢出限可達(dá)10 nmol/L，以及“8-17”脫氧核酶對(duì)Pb2+的特異性，使其對(duì)Pb2+具有高選擇性；測(cè)試條還具有足夠穩(wěn)定性，能長(zhǎng)期使用，檢測(cè)過(guò)程不需任何儀器。因此，該測(cè)試條可作為一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏、選擇性高和低成本的工具用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)Pb2+含量。

參考文獻(xiàn)：

[2]BARBASTE M，HALICZ L，GALY A，et al.Evaluation of the accuracy of the determination of lead isotope ratios in wine by ICP MS using quadrupole，multicollector magnetic sector and time-of-flight analyzers[J].Talanta，2001，54 （2）：307–317.

[3]GóRECKI T，PAWLISZYN J.Determination of tetraethyllead and inorganic lead in water by solid phase microextraction/gas chromatography[J].Analytical Chemistry，1996，68（17）：3008-3014.

[4]NDLOVU T，AROTIBA O A，SAMPATH S，et al.Electrochemical detection and removal of lead in water using poly modified recompressed exfoliated graphite electrodes[J].JournalofApplied Electrochemistry，2011，41（12）：1389-1396.

[5]LI J，LU Y.A highly sensitive and selective catalytic and biosensor for lead ions[J].Journal of the American Chemical Society，2000，122 （42） :10466-10467.

[6]LIU J，LU Y.A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles[J].Journal ofthe American ChemicalSociety，2003，125（22）：6642-6643.

[7]LIU J，LU Y.Accelerated color change of gold nanoparticles assembled by DNAzymes for simple and fast colorimetric Pb2+detection[J].Journal of the American Chemical Society，2004，126（39）： 12298-12305.

[8]LIU J，LU Y.Optimization of a Pb2+directed gold nanoparticle/DNAzyme assembly and its application as a colorimetric biosensor for Pb2+[J].Chemistry of Materials， 2004， 16（17）：3231-3238.

[9]NAM J M，THAXTON C S， MIRKIN C A.Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultra sensitive detection of proteins[J].Science，2003，301 （5641） :1884-1886.

[10]NAM J M，STOEVA S I，MIRKIN C A.Bio-barcode-based DNA detection with PCR-like sensitivity[J].Journal of the American Chemical Society，2004，126（19）： 5932-5933.

[11]MAZUMDAR D，LIU J，LU G，et al.Easy-to-use dipstick tests for detection of lead in paints using non-cross-linked gold nanoparticl-DNAzyme conjugates[J].Chemical Communications，2010，46 （9）：1416-1418.

[12]KNECHT M R，SETHI M.Bio-inspired colorimetric detection of Hg2+and Pb2+heavy metal ions using Au nanoparticles[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2009， 394（1）：33-46.

[13]LIN Y W，HUANG C C，CHANG H T.Gold nanoparticle probes for the detection of mercury，lead and copper ions[J].The Analyst，2011，136 （5）：863-864.

[14]KIM H K，RASNIK I，LIU J，et al.Dissecting metal ion–dependent folding and catalysis of a single DNAzyme[J].Nature Chemical Biology，2007，3 （12）：763-768.