呂玲燕 陳寶劍 吳永紹 孫如玉 汪燕玲 馬青艷 潘天彪

摘要：為了探討氨基酸對(duì)豬手工克隆（HMC）重構(gòu)胚發(fā)育效果的影響，比較了必需氨基酸（EAA）和非必需氨基酸（NEAA）對(duì)卵母細(xì)胞的成熟狀況以及對(duì)豬HMC重構(gòu)胚胎發(fā)育潛能的影響。結(jié)果表明，成熟培養(yǎng)液中添加EAA、NEAA及EAA+NEAA之間的成熟率差異不顯著，但均顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05）；胚胎培養(yǎng)液中添加EAA、NEAA及空白對(duì)照組的卵裂率都顯著高于EAA+NEAA（P<0.05）；囊胚率及細(xì)胞總數(shù)，NEAA組顯著高于空白對(duì)照組及EAA+NEAA組、EAA組（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：氨基酸；豬；重構(gòu)胚胎；發(fā)育效果

中圖分類號(hào)：S828 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）06-0108-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.06.027

Abstract： Effect of developmental potency of reconstructed embryos on pig handmade clone（HMC） of amino acid was investigated. In this study，we compared with the effect of the essential amino acid（EAA） and the essential amino acid （NEAA） on oocyte maturation rate and porcine HMC reconstructed embryos developmental potency. The results showed that the difference of maturation rate was not significant between the group of EAA，NEAA and EAA+NEAA in maturation medium，yet was significantly higher than the control group（P<0.05）；the cleavage rate of EAA group， NEAA group and the control group was significantly higher than EAA+NEAA group in embryo culture medium（P<0.05），as for the blastocyst rate and the total number of cells，the group of NEAA was significantly higher than the group of control， EAA+NEAA，EAA（P<0.05）.

Key words： amino acid；porcine；reconstructed embryos；developmental potency

隨著豬胚胎工程的發(fā)展，可以改良品種、培育抗病豬種、提高肉質(zhì)、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬或基因組修飾豬、制備人類疾病模型、進(jìn)行器官移植、生產(chǎn)藥物蛋白、研究發(fā)育機(jī)理等[1]。胚胎的體外培養(yǎng)是豬胚胎工程的主要環(huán)節(jié)之一，無(wú)論是體外受精（IVF）、核移植技術(shù)還是基因敲除，所生產(chǎn)的胚胎都要經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)，發(fā)育到適當(dāng)?shù)碾A段才能進(jìn)行后續(xù)的研究。影響豬胚胎體外發(fā)育的因素有很多，比如滲透壓大小[2]、氧化應(yīng)激反應(yīng)[2]、螯合劑[3]、能量基質(zhì)、氨基酸[4]等。而其中卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的成熟情況又是至關(guān)重要的，直接影響到后期胚胎的發(fā)育。有關(guān)氨基酸對(duì)豬卵母細(xì)胞的體外成熟及早期胚胎體外發(fā)育效果影響的報(bào)道鮮見(jiàn)，本試驗(yàn)探討不同氨基酸濃度對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟效率以及對(duì)手工克隆重構(gòu)胚胎發(fā)育效果的影響，從而優(yōu)化豬HMC的技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 胎牛血清（FBS）、TCM-199粉劑、DMEM粉劑購(gòu)置于美國(guó)Gbico公司，激素eCG、hCG購(gòu)置于美國(guó)Sigma公司，其他化學(xué)試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均購(gòu)置于美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 儀器 細(xì)胞融合儀型號(hào)：ECM2001、融合槽型號(hào)：BTX 450、胚胎積聚針型號(hào)：DN-10式、卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)皿：35 mm及60 mm 塑料平皿、去核切割刀自制、胚胎培養(yǎng)皿：四孔板。

1.2 方法

1.2.1 卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng) 取卵巢表面2～6 mm的卵泡，于試管中靜置，棄去上清，留沉淀部分分裝。挑選含有3層及以上有顆粒/卵丘細(xì)胞包被、折光性良好的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），放入成熟液中（含10 IU/mL hCG+10 IU/mL eCG）培養(yǎng)，將卵母細(xì)胞隨機(jī)分成4組：①空白對(duì)照組；②添加2%必需氨基酸（EAA）；③添加1%非必需氨基酸（NEAA）；④同時(shí)添加2%必需氨基酸（EAA）和1%非必需氨基酸（NEAA），20～22 h后換成不含激素的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)18～20 h至細(xì)胞成熟。

1.2.2 供體細(xì)胞的處理 分離出胎豬大腿組織，將其剪碎至2～3 mm的組織塊，加入少量含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，均勻鋪開，在皿蓋做好標(biāo)記，將其倒扣于培養(yǎng)箱中，4 h后加入少量培養(yǎng)液，防止組織塊漂浮。24 h后在平皿底部加滿培養(yǎng)液，48 h后繼續(xù)觀察成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，待成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)至90%左右匯合度時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用作豬手工克隆供體細(xì)胞。

1.2.3 重構(gòu)胚的構(gòu)建、培養(yǎng)以及囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù) 將帶核的卵母細(xì)胞置于含2.5 μg/mL CB的切割液中去核，等其恢復(fù)成圓形后，與已處理好的供體細(xì)胞進(jìn)行黏合，形成卵-供體-卵式的黏合體（形成三角狀），移入電融合液中進(jìn)行一步融合，參數(shù)為AC：6 V/cm；DC：1.2 kV/cm，30 μs，2 DC，電激活后放入培養(yǎng)箱中恢復(fù)30 min，然后檢查其融合/激活情況。將融合后的重構(gòu)胚放入PZM-3中激活，其含5 μg/mL CB和10 μg/mL CHX，每滴激活液中放入1枚重構(gòu)胚，激活4 h。胚胎培養(yǎng)隨機(jī)分成4組：①空白對(duì)照組； ②添加2%必需氨基酸（EAA）；③添加1%非必需氨基酸（NEAA）；④同時(shí)添加2%必需氨基酸（EAA）和1%非必需氨基酸（NEAA）。48 h觀察卵裂率，160～168 h觀察囊胚率。在培養(yǎng)后6～7 d收集囊胚，置于Hoechst 33342染液中，石蠟-凡士林封片，熒光顯微鏡下觀察記錄囊胚細(xì)胞總數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)由SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)每重復(fù)1次均為同1批次試驗(yàn)，使用相同來(lái)源的卵巢和試驗(yàn)條件，所有試驗(yàn)至少重復(fù)4次。

2 結(jié)果與分析

2.1 EAA、NEAA及EAA+NEAA對(duì)卵母細(xì)胞成熟效率的影響

卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)液中添加EAA及NEAA，濃度分別為2%EAA、1%NEAA、2%EAA+1%NEAA，培養(yǎng)40～44 h。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加2%EAA組、1%NEAA組及2%EAA+1%NEAA組之間的差異不顯著，但均顯著高于空白對(duì)照組，結(jié)果見(jiàn)表1及圖1。

2.2 EAA、NEAA及EAA+NEAA對(duì)重構(gòu)胚發(fā)育效果的影響

胚胎培養(yǎng)液中添加EAA及NEAA，濃度分別為2%EAA、1%NEAA、2%EAA+1%NEAA，培養(yǎng)160～168 h。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加2%EAA組、1%NEAA組及空白對(duì)照組的卵裂率顯著高于2%EAA+1%NEAA組（P<0.05）；就囊胚率及細(xì)胞總數(shù)而言，1%NEAA組顯著高于空白對(duì)照組及2%EAA+1%NEAA組、1%EAA組（P<0.05），結(jié)果見(jiàn)表2及圖2。

3 討論

氨基酸的主要生理作用主要包括合成蛋白質(zhì)和核苷酸、提供營(yíng)養(yǎng)和能量、調(diào)節(jié)滲透壓，抗氧化、調(diào)節(jié)pH、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的生物合成，以及參與滋養(yǎng)外胚層分化和內(nèi)外胚層之間基膜形成[6]。雖然對(duì)氨基酸代謝機(jī)制的研究取得了一定的進(jìn)展，但其確切的作用機(jī)理尚不明了，添加氨基酸是否對(duì)豬卵母細(xì)胞、胚胎的體外培養(yǎng)有利一直存在爭(zhēng)議[5，7-9]。

就氨基酸對(duì)卵母細(xì)胞的成熟作用而言，侯文文[8]研究表明，不同濃度必需氨基酸和非必需氨基酸添加到豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)在成熟率上，試驗(yàn)組與對(duì)照組都沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。馬紅等[9]研究表明在卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)液中添加1%EAA、1%NEAA及1%EAA+1%NEAA均能提高卵母細(xì)胞在體外的成熟率，且都顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），本試驗(yàn)的研究成果與馬紅等[9]得出的結(jié)論相一致。

就氨基酸對(duì)胚胎體外發(fā)育效果作用而言，信吉閣等[10]研究表明在胚胎培養(yǎng)液中添加氨基酸能提高豬孤雌激活胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚細(xì)胞總數(shù)，且明顯高于空白對(duì)照組。鄭云勝等[11]研究表明，綿羊胚胎體外培養(yǎng)時(shí)，NEAA和EAA具有互補(bǔ)性，NEAA促進(jìn)囊胚以前的發(fā)育，EAA促進(jìn)囊胚以后的發(fā)育。成俊萍等[12]研究表明，NEAA可顯著提高水牛卵母細(xì)胞IVF后胚胎的分裂率，但對(duì)囊胚發(fā)育率無(wú)顯著影響，低濃度的EAA對(duì)水牛IVF胚胎的發(fā)育具有一定促進(jìn)作用，但高濃度則有抑制作用。結(jié)果表明，成熟培養(yǎng)液中添加EAA、NEAA及空白對(duì)照組的卵裂率都顯著高于EAA+NEAA組（P<0.05），這可能是由于EAA和NEAA之間的相互作用，產(chǎn)生的某些化學(xué)物質(zhì)降低了HMC重構(gòu)胚發(fā)育的卵裂率；就囊胚率及細(xì)胞總數(shù)而言，NEAA組顯著高于空白對(duì)照組及EAA+NEAA組、EAA組（P<0.05），這與前人的研究結(jié)果基本保持一致。在胚胎發(fā)育的不同階段對(duì)氨基酸的需求量是不同的，EAA雖對(duì)早期分裂胚胎有抑制作用，但對(duì)8～16細(xì)胞之后的胚胎發(fā)育沒(méi)有任何不利影響，而NEAA在8～16細(xì)胞至囊胚階段，對(duì)哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育也有促進(jìn)作用[13]。另外必需氨基酸和非必需氨基酸種類很多，它們相互之間及其與培養(yǎng)液中其他成分的作用比較復(fù)雜，只有充分了解他們之間的相互作用，以及卵母細(xì)胞和胚胎各個(gè)發(fā)育時(shí)期對(duì)氨基酸的需求量，才能更有效地調(diào)整培養(yǎng)條件以期提高HMC重構(gòu)胚胎的體外發(fā)育能力。

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