劉紅芳

（長(zhǎng)江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶涪陵，408100）

香樟系樟樹屬的常綠喬木植物，是我國(guó)亞熱帶常綠闊葉林的主要樹種之一，屬藥用植物，具有理氣、活血、解表、祛風(fēng)除濕等功效[1，2]。關(guān)于樟樹精油的抑菌作用及其化學(xué)成分有過許多研究[3～7]，但對(duì)于樟樹葉乙醇提取物的抑菌效果及活性成分研究不多。本文研究了香樟乙醇提取物對(duì)莖瘤芥（榨菜）黑斑病的抑菌活性，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析了其化學(xué)成分，初步明確了香樟乙醇提取物的抑菌活性成分，旨在為植物源抑菌農(nóng)藥新資源的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

供試的莖瘤芥（榨菜）黑斑病菌為長(zhǎng)江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院園藝植物病蟲害防治實(shí)驗(yàn)室從莖瘤芥上分離、純化、鑒定后保存下來的菌株。無菌條件下將黑斑病菌接入PDA培養(yǎng)基，在25℃條件下暗培養(yǎng)7 d備用。

1.2 香樟乙醇提取物的制備

采用冷浸法提取[8]：采集香樟葉，用清水清洗干凈，在室內(nèi)自然陰干表面水分后放入鼓風(fēng)干燥箱（45～50℃）烘干直至發(fā)脆，裝入1 000 mL平底磨口燒瓶?jī)?nèi)，加入95%乙醇完全浸沒香樟葉片，蓋上玻璃磨口塞，室溫下浸泡5 d后用4層紗布過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（55℃）加壓濃縮至膏狀物，移裝于棕色磨口瓶?jī)?nèi)，放在冰箱中（4℃）備用。

1.3 香樟提取物對(duì)莖瘤芥黑斑病的抑制作用

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定香樟提取物對(duì)莖瘤芥黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性[9]：稱取 240、120、60、30 mg香樟提取物，分別加入裝有60 mL已經(jīng)融化的PDA培養(yǎng)基中，提取物在培養(yǎng)基中的濃度分別為 4.0、2.0、1.0、0.5 mg/mL，混勻后倒入直徑 9 cm 的培養(yǎng)皿中（每皿20 mL，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)），冷凝后分別接入直徑0.8 cm病菌的菌餅，菌絲面向下，置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以不加香樟提取物的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。培養(yǎng)7 d后測(cè)定菌落直徑，根據(jù)下面公式計(jì)算抑制效果。

菌落直徑=測(cè)量直徑-8.0（菌餅直徑）；抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100。

根據(jù)不同濃度的抑制率，換算成幾率值，各處理的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)（mg/mL）換成對(duì)數(shù)值，采用SPSS 17.0軟件分析，求出毒力回歸方程，算出EC50。

1.4 GC/MS分析條件

①色譜條件 弱極性DB-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm）。 進(jìn)樣口溫度：280℃；升溫程序：初溫40℃，保持 3min，以3℃/min升至140℃，再以 5℃/min升至 210℃，保持 5 min；載氣（He），純度大于 99.999%，流速 1.2 mL/min；分流進(jìn)樣，分流比50∶1。強(qiáng)極性DB-WAXetr彈性石英毛細(xì)管柱（60 m×320 μm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度260℃；升溫程序同DB-5MS柱；分流進(jìn)樣，分流比100∶1。

②質(zhì)譜條件 EI離子源，電子能量70 eV，掃描范圍 m/z（荷質(zhì)比）45～550，四極桿溫度 150℃，離子源溫度230℃。

1.5 成分鑒定及定量

提取物經(jīng)質(zhì)譜掃描后，在色譜工作站得到總離子流量圖，檢索NISTDEMO標(biāo)準(zhǔn)譜庫，進(jìn)行譜圖解析，確定各色譜峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)重疊峰進(jìn)行分辨，用峰面積歸一法對(duì)各化合物進(jìn)行定量，計(jì)算出各組分的相對(duì)含量[10，11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 香樟提取物對(duì)莖瘤芥黑斑病病菌的抑制作用

從表1可以看出，不同濃度的香樟提取物對(duì)病菌的抑制作用不同，設(shè)置的 4.0、2.0、1.0、0.5 mg/mL 4個(gè)濃度對(duì)莖瘤芥黑斑病菌生長(zhǎng)的抑制率分別是 63%、58%、53%、49%。抑制作用隨著設(shè)置濃度的減小逐漸下降，0.5 mg/mL時(shí)，抑制率不足50%。香樟乙醇提取物4個(gè)濃度對(duì)莖瘤芥黑斑病菌的抑制作用均與對(duì)照差異極顯著。

將不同濃度的抑制率換算成幾率值，各處理的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)（mg/mL）換成對(duì)數(shù)值，用SPSS 17.0軟件分析，得出毒力回歸方程為=4.840 7-0.304 6 x，EC50為0.299 9，95%置信區(qū)間 （%） 為 0.252 6～0.356 1，相關(guān)系數(shù)（）為-0.997 5。

表1 香樟提取物對(duì)莖瘤芥黑斑病菌的抑制作用

表2 香樟乙醇提取物抑菌活性成分分析

2.2 香樟乙醇提取物對(duì)莖瘤芥黑斑病的抑制活性成分分析

圖1為香樟乙醇提取物的氣相色譜，相關(guān)化合物的鑒定如表2所示。譜峰出峰時(shí)間大都集中在11～19 min。香樟的乙醇提取物中共鑒定出21個(gè)化合物，包括烯烴、炔烴、醛、酮、醇、醚、酯等多種成分。其成分主要為酯類化合物，包括飽和脂肪酸酯與不飽和脂肪酸酯：14-甲基十五酸甲酯 （0.41%）、棕櫚酸乙酯（13.61%）、十七烷酸乙酯（1.07%）、丁二酸二甲酯 （0.79%）、十七碳烯酸甲酯 （0.20%）、9，12，15-十八碳三烯酸甲酯（42.92%）。另外，石竹烯氧化物（3.90%）、1-環(huán)己基丙炔 （7.38%）、2-（1-咪唑基）乙酸（7.25%）、4-甲氧基苯甲醇（3.77%）、葉綠醇（8.46%）等化合物也較豐富。可見，香樟的乙醇提取物的主要成分是含氧化合物，共16個(gè)，占提取物總量的79.46%，其中，醛類化合物1個(gè)，含量為0.43%；醇類化合物為6個(gè)，含量為15.56%；環(huán)醚1個(gè)，含量為3.90%；飽和脂肪酸酯類4個(gè)，含量為15.88%；不飽和脂肪酸酯類化合物2個(gè)，含量為43.12%。含氧且含氮化合物2個(gè)，含量為10.48%。另外，烯烴、炔烴各1個(gè)，含量分別為1.72%、7.38%。由以上分析可總結(jié)出，香樟的乙醇提取液中酯類物質(zhì)居多，且以9，12，15-十八碳三烯酸甲酯、棕櫚酸乙酯為主要成分。

圖1 香樟乙醇浸提物的GC-MS總離子流

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定了香樟提取物對(duì)莖瘤芥黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性，發(fā)現(xiàn)設(shè)置的4個(gè)濃度對(duì)病菌的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，但隨著濃度的減小，抑制作用逐漸下降，0.5 mg/mL時(shí)，抑制率不足50%。方差分析結(jié)果顯示，不同濃度處理的莖瘤芥黑斑病病菌直徑均明顯低于對(duì)照。通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）檢測(cè)香樟葉的乙醇浸提物的化學(xué)成分，共檢測(cè)出21種化合物，包括烯烴、炔烴、醛、酮、醇、醚、酯等多種成分。其成分主要為酯類化合物，包括飽和脂肪酸酯與不飽和脂肪酸酯，占提取物總量的79.46%。

我國(guó)樟樹資源非常豐富，其乙醇提取物的抑菌活性的研究為提高樟樹綜合經(jīng)濟(jì)效益提供了依據(jù)。為了加深樟樹作為植物源殺菌劑的開發(fā)和利用，應(yīng)進(jìn)一步研究其對(duì)莖瘤芥黑斑病菌抑菌活性的作用方式和作用機(jī)理等，并深入研究其對(duì)其他植物病原真菌的生物活性。

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