付敏軍，張君，潘珍珍，鄭紅斌

浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)是發(fā)病于腸道黏膜及黏膜下層的慢性炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)多為反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉、黏液膿血便及里急后重等癥狀，可伴有關(guān)節(jié)、皮膚、眼、口及肝膽等腸外表現(xiàn)。該病臨床癥狀隨病變程度而輕重不等，病程遷延不愈，反復(fù)發(fā)作，甚者并發(fā)結(jié)直腸癌變，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一[1～2]。早在上世紀(jì)中葉，國內(nèi)就有UC的報道，近年來隨著腸鏡的推廣運用和人們物質(zhì)生活水平的提高，UC的發(fā)病率劇增，但時至今日，其發(fā)病機制和有效治療藥物仍在進一步探索中。報道顯示免疫細胞、腸上皮細胞的凋亡可導(dǎo)致腸道免疫屏障和機械屏障的損傷，誘導(dǎo)或加重UC病情的發(fā)展[3～4]，進一步研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)可通過激活C/EBP同源蛋白(C/ERP homologous protein，CHOP)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)、c-JUN氨基端激酶(JNK)等通路引起細胞凋亡[5～7]。

麥纖散是鄭紅斌教授在“發(fā)芽大麥防治UC的作用機制與臨床應(yīng)用”這一訪日留學(xué)成果的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年中醫(yī)藥防治UC經(jīng)驗研制而成，目前已獲得國家發(fā)明專利(專利號：ZL201410138907.4)。相關(guān)研究表明該制劑能促進UC大鼠盲腸內(nèi)容物丁酸和結(jié)腸黏膜組織中B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)表達，抑制血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)和結(jié)腸黏膜組織Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein gene，Bax)表達，修復(fù)受損腸道黏膜，對UC具有較好的療效[8]。為優(yōu)化此散劑的療效，針對UC血便癥狀，增加白及組成新麥纖散。本研究將從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)CHOP細胞凋亡途徑，觀察新麥纖散對UC大鼠結(jié)腸組織活化轉(zhuǎn)錄因 子 -4(Activating transcription factor-4， ATF-4)和CHOP蛋白和mRNA表達的影響，探析新麥纖散對UC的療效及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±

20)g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(滬)2013-0016，常規(guī)飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，SPF級實驗室，實驗室環(huán)境：恒溫，溫度(22±1)℃，濕度50%～60%。

1.2 實驗藥物 精選優(yōu)質(zhì)發(fā)芽大麥，經(jīng)去糖化、烘干、碾碎、堿-酶結(jié)合法提取麥芽纖維。將優(yōu)質(zhì)的山藥、茯苓、馬齒莧、三七和白及(購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)門診部)制成超細粉末，過120目標(biāo)準(zhǔn)篩，與麥芽纖維按2∶2∶1∶1∶1∶3質(zhì)量比充分混勻制成新麥纖散，加蒸餾水配成一定濃度的混懸液，4℃保存?zhèn)溆?。美沙拉嗪緩釋顆粒(上海愛的發(fā)制藥有限公司，批號：H20143164)，于研缽中搗碎，加蒸餾水配成一定濃度的混懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗試劑 葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulfate Sodium，DSS)(美國MP公司，貨號：0216011080，分子量36000-50000)，用蒸餾水將DSS粉末配成新鮮的 5%DSS溶液；一抗ATF-4(美國 Cell Signaling Technology公司，貨號：11815S)；一抗CHOP(美國Cell Signaling Technology公司，貨號：2895T)；RNA提取試劑盒、RT試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]。

1.4 造模、分組及干預(yù) 60只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、美沙拉嗪組、新麥纖散低、中、高劑量組，每組10只。除正常組外，其余組大鼠飲用5%DSS溶液，代替純凈水自由飲用，保證每天足量，連續(xù)飲用1周，當(dāng)大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量明顯下降、泄瀉、便血等癥狀時表明UC模型誘導(dǎo)成功。在此過程中，模型組大鼠因人為因素死亡1只。造模成功后，大鼠與人每公斤體重劑量折算系數(shù)為6.25，美沙拉嗪組灌胃美沙拉嗪緩釋顆?；鞈乙?.42 g/(kg·d)，新麥纖散低、中、高劑量組分別灌胃新麥纖散混懸液1.5、3、6 g/(kg·d)，其余組大鼠予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)干預(yù)2周。

1.5 標(biāo)本采集 末次給藥24 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉解剖大鼠；肉眼觀察結(jié)腸組織，選取病變嚴(yán)重部位，一部分置于10%福爾馬林溶液中固定，一部分放入凍存管，保存于液氮中。

1.6 病理切片觀察及組織病理學(xué)評分 取大小約為2.0 cm×1.0 cm×0.3 cm的結(jié)腸標(biāo)本，梯度脫水，石蠟包埋、切片、HE染色后，觀察并評估各組結(jié)腸組織的病理變化，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

1.7 Western Blot法檢測結(jié)腸組織ATF-4、CHOP蛋白的表達 結(jié)腸組織蛋白提取變性后上樣，每孔上樣總蛋白量為40 μg，電泳轉(zhuǎn)膜后，加一抗、二抗，室溫孵育1 h，顯色曝光，采用β-actin作為內(nèi)參蛋白，以灰度值比值表示蛋白相對表達水平。

1.8 RT-PCR法檢測結(jié)腸組織ATF-4、CHOP mRNA的表達 取大鼠結(jié)腸組織約20 mg，參照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后用實時熒光定量PCR儀進行擴增，擴增反應(yīng)條件為：95℃，3 min；95℃，10 s，60℃，30 s(48 個循環(huán))。Bio-Rad iQ5 PCR儀收集反應(yīng)結(jié)果，利用公式2-△△CT計算ATF-4、CHOP的轉(zhuǎn)錄水平。引物設(shè)計、合成均由上海生工生物工程股份有限公司完成，其序列見表2。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0進行分析處理，計

表2 引物序列

量資料以(x±s)表示。若符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析進行組間比較；若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)秩和檢驗進行分析比較。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 正常組大鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)有光澤，動作敏捷，飲食正常；大鼠飲用DSS后出現(xiàn)體質(zhì)量減輕，有腹瀉、血便等癥狀，后期癥狀加重，肛周有污穢物黏附，精神差、飲食不佳等癥狀。新麥纖散治療后，UC大鼠血便、腹瀉癥狀均有不同程度的改善，體質(zhì)量增加，動作較正常。

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理切片觀察 見圖1。正常組大鼠結(jié)腸黏膜完整，未見潰瘍、水腫，也無炎癥細胞浸潤。模型組則見杯狀細胞畸形、減少，腺體排列不規(guī)則，淋巴細胞浸潤明顯。經(jīng)新麥纖散和美沙拉嗪干預(yù)后，未見或少見潰瘍、中性粒細胞等炎癥細胞浸潤，腺體也有不同程度的改善，其中新麥纖散中、高劑量組和美沙拉嗪組好轉(zhuǎn)較為明顯，優(yōu)于新麥纖散低劑量組。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理切片觀察 (×200)

2.3 各組大鼠結(jié)腸病理損傷評分比較 見表3。與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸病理損傷評分顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，美沙拉嗪組、新麥纖散低、中、高劑量組大鼠結(jié)腸病理損傷評分顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織ATF-4、CHOP蛋白表達水平比較 見圖2、表4。與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織ATF-4、CHOP蛋白表達增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，美沙拉嗪組和新麥纖散中、高劑量組ATF-4、CHOP蛋白減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組大鼠結(jié)腸病理損傷評分比較(±s) 分

表3 各組大鼠結(jié)腸病理損傷評分比較(±s) 分

與正常組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別正常組模型組美沙拉嗪組新麥纖散低劑量組新麥纖散中劑量組新麥纖散高劑量組n 10 9 10 10 10 10評分0.00±0.00 2.33±0.50①0.60±0.21②0.90±0.46②0.65±0.24②0.70±0.26②

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織ATF-4、CHOP蛋白表達結(jié)果

表4 各組大鼠結(jié)腸組織ATF-4、CHOP蛋白表達水平比較(x±s)

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織ATF-4、CHOP mRNA表達比較 見表5。與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織ATF-4、CHOP mRNA表達增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，美沙拉嗪組和新麥纖散低、中、高劑量組大鼠結(jié)腸組織ATF-4、CHOP mRNA表達減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

UC的發(fā)病與免疫、遺傳等因素相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細胞凋亡關(guān)系也十分密切。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、加工、轉(zhuǎn)輸、脂質(zhì)合成、維持鈣離子穩(wěn)定的一個重要細胞器，對內(nèi)外環(huán)境的改變十分敏感，理化因素、缺氧缺血、病原微生物等均可導(dǎo)致大量未折疊或錯誤折疊的蛋白聚集，鈣離子平衡失調(diào)，誘發(fā)ERS，此時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)將啟動未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，通過激活蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase related endoplasmic reticulum kinase，PERK)、 肌 醇 需 求 酶 1(inositol requiringkinase1，IRE1)、活化轉(zhuǎn)錄因子-6(activatingtranscription factor-6，ATF-6)3種跨膜蛋白及其相關(guān)下游靶點，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的正常運轉(zhuǎn)，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行自我修復(fù)和保護。然而長時間或高強度的應(yīng)激將會介導(dǎo)CHOP等細胞凋亡途徑，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細胞的凋亡，致使受損腸道黏膜屏障修復(fù)困難，引起UC反復(fù)發(fā)作、病程纏綿[9～10]。ERS激烈持續(xù)時，作為與UC關(guān)系最為密切的通路，PERK發(fā)生自身磷酸化而被活化，進而激活A(yù)TF-4，協(xié)調(diào)氨基酸的生物合成和轉(zhuǎn)運，增加伴侶分子的合成，促進抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，上調(diào)蛋白分泌相關(guān)基因的表達，同時轉(zhuǎn)移到細胞核的ATF-4作用于下游的轉(zhuǎn)錄靶點CHOP，促進CHOP蛋白的大量表達，使應(yīng)激的細胞進入了凋亡階段[11～14]。

表5 各組大鼠結(jié)腸組織ATF-4、CHOP mRNA表達比較(x±s)

UC歸屬中醫(yī)休息痢、腸澼等范疇，古往今來，歷代學(xué)者對其均有研究。中醫(yī)學(xué)認為，UC發(fā)病本于脾胃虛弱，濕濁內(nèi)生，濕、熱、瘀毒雜合為其標(biāo)，病位在腸道。脾胃虛弱，兼或外感濕邪，或進食辛辣，導(dǎo)致濕熱蘊結(jié)腸道，搏擊氣血，致使腸絡(luò)受損，出現(xiàn)黏液膿血便、腹瀉等癥狀。新麥纖散正是基于此病因病機配伍而成，方中麥芽消食助運，茯苓、山藥化濕和中，補脾固腸，馬齒莧清腸解毒止痢，三七、白及止血排膿、化瘀斂瘡，全方共奏健脾固腸化濕、清腸解毒化瘀之功。

實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠結(jié)腸組織病理改變嚴(yán)重，ATF-4、CHOP蛋白和mRNA的水平均升高(P＜0.05)，表明UC大鼠腸道黏膜細胞已進入凋亡狀態(tài)。新麥纖散中、高劑量組治療后，UC大鼠血便改善，精神好轉(zhuǎn)，結(jié)腸組織炎癥和損傷減輕，ATF-4、CHOP蛋白和mRNA的表達均減少(P＜0.05)，這表明新麥纖散可能通過抑制結(jié)腸組織ATF-4、CHOP蛋白和mRNA的表達，減少腸道黏膜細胞的凋亡，對UC大鼠起到保護作用。

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