趙雪梅， 邵自強(qiáng)

我國腦血管病(cerebral infarction，CI)的發(fā)病率日趨升高，成為我國人口死亡的第2大病因，因此已經(jīng)成為嚴(yán)重的社會健康問題[1,2]。因此研究腦血管病的病因和優(yōu)良的防治方案迫在眉睫。腦血管病的發(fā)病因素較為復(fù)雜，目前己知的包括糖尿病、高血脂、高血壓、吸煙、肥胖等都是腦血管病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素[3]，近年研究發(fā)現(xiàn)，血漿中同型半胱氨酸(Hcy)的水平與腦梗死的發(fā)生密切相關(guān)，高Hcy血癥可引起腦梗死發(fā)病率升高。因此，腦梗死與Hcy相關(guān)代謝酶基因多態(tài)性的研究備受關(guān)注[1]。

在甲硫氨酸合成酶(methionine synthase,MS)的催化作用下，Hcy可被轉(zhuǎn)化為半胱氨酸或甲硫氨酸，因此MS的活性調(diào)控著血漿中Hcy的水平[4]，在此代謝過程中，維生素B12是其重要輔助因子，在Hcy代謝過程中發(fā)揮重要作用，與腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[5]。研究表明，Hcy代謝相關(guān)酶的基因突變可能引起血漿中Hcy水平升高[6]。多個(gè)基因位點(diǎn)變化被報(bào)道[7～9]，如亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR)，其純合基因突變引起酶活性降低而影響Hcy的代謝。有研究發(fā)現(xiàn)，MS2756和MTRR66的A→G突變會引起Hcy水平升高和心腦血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加，但也有不同意見[9,10]。因此本研究旨在探討Hcy相關(guān)酶基因MS A2756G和MTRR A66G基因多態(tài)性與維生素B12對Hcy代謝的影響及與腦梗死的關(guān)系，為尋找腦血管病易感基因及其防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2014年2月-2016年2月在中日友好醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確診為急性腦梗死患者100例作為病例組，選取同期的健康體檢者100例為對照組。研究對象排除患有癲癇、甲狀腺疾病、嚴(yán)重肝腎疾病、惡性腫瘤、有嚴(yán)重營養(yǎng)不良或者有嚴(yán)重免疫系統(tǒng)疾病等情況，1 m內(nèi)服用過葉酸、多巴胺類藥物等可影響血漿中Hcy水平的患者。本研究所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本留取所有研究對象于禁食 12 h 后清晨抽取靜脈血3 ml，用于Hcy和維生素B12的檢測和基因型檢測。

1.3 同型半胱氨酸(Hcy)和維生素B12的檢測 用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血漿中Hcy和維生素B12的含量，方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 樣本DNA提取 取樣本血清加1 ml紅細(xì)胞裂解液，12000轉(zhuǎn)離心5 min，棄上清液，重復(fù)兩次，加200 μl雙蒸水，充分振蕩使沉淀完全溶解。加200 μl白細(xì)胞裂解液，上下顛倒幾次，加入200 μl蛋白沉淀劑，充分混勻，室溫放置3 min，12000轉(zhuǎn)離心10 min取上清液，重復(fù)操作一次。在上清中加入1 ml無水乙醇，室溫靜置10 min，輕輕混勻使得產(chǎn)生DNA絮狀沉淀，12000轉(zhuǎn)離心10 min，棄上清，加30 ml雙蒸水溶解DNA，分光光度法檢測DNA濃度，放于-20 ℃冰箱保存。

1.5 PCR-RFLP分析 MS A2756G和MTRR A66G經(jīng)PCR擴(kuò)增后使用內(nèi)切酶消化，其中MS A2756G使用Hae Ⅲ內(nèi)切酶、MTRR A66G使用NadeI內(nèi)切酶，反應(yīng)產(chǎn)物使用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測酶切片段大小。

1.6 腺苷鈷胺干預(yù)試驗(yàn) 將所選取的100例腦梗死患者隨機(jī)分為兩組，每組50例，在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)組予以每天攝入0.5～1 mg腺苷鈷胺(華北制藥股份有限公司)的干預(yù);而非試驗(yàn)組不服用，1 w后，檢測患者血漿中Hcy水平。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者一般資料 比較病例組年齡(65.3±2.8)歲,對照組(66.8±3.3)歲，兩組年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=1.23，P>0.05)；病例組性別構(gòu)成46/54(男/女)，對照組48/52(男/女)，兩組性別構(gòu)成無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=2.09，P>0.05)。

2.2 兩組血漿中Hcy水平和維生素B12水平 分析病例組血漿中Hcy的濃度為(17.36±6.36)μmol/L、維生素B12的濃度為(12.37±2.02)nmol/L;對照組血漿中Hcy的濃度為(13.45±4.66)μmol/L、維生素B12的濃度為(16.54±2.98)nmol/L。病例組血漿中Hcy的水平明顯高于對照組(t=8.65，P<0.05);維生素B12的水平明顯低于對照組(t=6.22，P<0.05)，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P<0.05)。兩組血漿中維生素B12的水平與Hcy的水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

2.3 MS A2756G和MTRR A66G的基因型多態(tài)性對血漿中Hcy水平的影響 兩組研究對象中MS A2756G和MTRR A66G不同基因型分布的患者血漿中Hcy濃度的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)：病例組MS 2756AA(野生型純合子)、MS 2756AG(突變型雜合子)、MS 2756GG(突變型純合子)基因型的患者血清中Hcy的濃度分別為13.22±2.56、16.43±5.37、19.86±6.21;對照組MS 2756AA、MS 2756AG、MS 2756GG基因型的研究對象血漿中Hcy的濃度分別為9.96±1.53、11.78±2.01、14.46±2.39。病例組不同基因分型的研究對象血漿中Hcy的濃度均明顯高于對照組，而無論病例組還是對照組MS A2756G突變都引起血漿中Hcy水平的明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P<0.05)。病例組MTRR 66AA(野生型純合子)、MTRR 66AG(突變型雜合子)、MTRR 66GG(突變型純合子)基因型的患者血漿中Hcy的濃度分別為14.23±1.13、16.83±3.48、19.29±5.26;對照組MTRR 66AA、MTRR66AG、MTRR 66GG基因型的研究對象血漿中Hcy的濃度分別為11.36±1.76、13.31±2.90、15.28±3.56。病例組不同基因分型的研究對象血漿中Hcy的濃度均明顯高于對照組，而無論病例組還是對照組MTRR A66G突變都引起血漿中Hcy水平的明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P<0.05)(見表1)。

2.4 MS A2756G和MTRR A66G多態(tài)性與腦梗死的關(guān)聯(lián)分析 兩組基因多態(tài)性結(jié)果顯示：病例組MS 2756AA、AG、GG的基因型頻率分別為55.0%、26.0%、19.0%；對照組MS 2756AA、AG、GG的基因型頻率分別為66.0%、17.0%、17.0%；兩組A、G等位基因的分布頻率有顯著性差異(P<0.05)。且關(guān)聯(lián)分析顯示，MS A2756G基因型AG、GG、AG+GG的相對風(fēng)險(xiǎn)度OR(Odds Ratio)值分別為2.11、1.75和2.01，說明MS A2756G多態(tài)性與腦梗死具有顯著相關(guān)性。病例組 MTRR 66AA、AG、GG的基因型頻率分別為30.0%、39.0%、31.0%；對照組MTRR 66AA、AG、GG的基因型頻率分別為44.0%、28.0%、28.0%；兩組A、G等位基因的分布頻率有顯著性差異(P<0.05)。且關(guān)聯(lián)分析顯示，MTRR A66G基因型AG、GG、AG+GG的OR值分別為2.19、1.86和2.32，可知MTRRA66G多態(tài)性與腦梗死具有顯著相關(guān)性(見表2)。

2.5 腺苷鈷胺干預(yù)對腦梗死患者血漿中Hcy水平的影響 100例腦梗死患者隨機(jī)分為兩組，每組50例。治療前試驗(yàn)組血漿中Hcy水平為(17.21±5.27)μmol/L;非試驗(yàn)組Hcy水平為(17.42±5.25)μmol/L，兩組Hcy水平均無顯著性差異(t=1.03，P=0.77)，具有可比性。兩組患者在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)組每天給予腺苷鈷胺干預(yù);而非試驗(yàn)組不予干預(yù)。1 w后，干預(yù)組患者血漿中Hcy濃度為(14.12±2.46)μmol/L;非干預(yù)組患者血漿中Hcy的濃度為(15.39±4.77)μmol/L;試驗(yàn)組血漿中Hcy的水平顯著低于非試驗(yàn)組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(t=7.29，P<0.05)。

項(xiàng)目病例組(例)對照組(例)MS2756AAMS2756AGMS2756GGMTRR66AAMTRR66AGMTRR66GG13.22±2.56(55)*16.43±5.37(26)*#19.86±6.21(19)*#14.23±1.13(30)*16.83±3.48(39)*#19.29±5.26(31)*#9.96±1.53(66)11.78±2.01(17)#14.46±2.39(17)#11.36±1.76(44)13.31±2.90(28)#15.28±3.56(28)#

病例組與對照組*P﹤0.05;突變型基因與野生型基因#P﹤0.05

表2 兩組基因多態(tài)性與腦血管病的關(guān)聯(lián)分析

病例組與對照組*P﹤0.05

3 討 論

近年來，大量的研究發(fā)現(xiàn)，血漿中Hcy水平的升高是心腦血管疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，部分學(xué)者[11，12]研究發(fā)現(xiàn)腦梗死患者血漿中Hcy的濃度明顯高于正常人群。本研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死患者血漿中Hcy水平較健康人群明顯升高，也驗(yàn)證了血漿中高Hcy水平可能是腦梗死的重要危險(xiǎn)因素。

MS是Hcy代謝過程中重要的催化酶，對血漿Hcy水平的調(diào)控發(fā)揮重要作用[13]。由于不同的MS基因型的個(gè)體差異，其基因多態(tài)性與疾病之間的關(guān)聯(lián)受到重視。有研究發(fā)現(xiàn)MS的基因多態(tài)性與冠心病、神經(jīng)管缺陷等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。MS存在多個(gè)位點(diǎn)突變，研究發(fā)現(xiàn)MS2756A→G的突變會引起Hcy水平升高，進(jìn)而提高心腦血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，不過尚未得到公認(rèn)。本研究發(fā)現(xiàn)，MS A2756G的基因型頻率分布在腦梗死患者和健康人群中具有顯著性差異，MS A2756G的基因多態(tài)性與腦梗死具有顯著相關(guān)性。另外，對MS A2756G不同基因型的研究對象血漿中Hcy濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)無論是腦梗死患者人群還是正常人群MS A2756G突變都伴隨血漿中Hcy濃度的顯著升高。結(jié)果提示，MS A2756G的突變可以引起血漿中Hcy水平的上升，這在腦梗死的發(fā)生發(fā)展過程中起到一定的推動(dòng)作用。

MTRR可催化產(chǎn)生與MS結(jié)合的甲基B12，維持MS酶活性的穩(wěn)定[14]。MTRR基因較為普遍的突變是66A→G，已有研究發(fā)現(xiàn)，MTRR 66位基因突變型的人群血漿中Hcy水平升高;而其位點(diǎn)多態(tài)性與腦梗死是否具有相關(guān)性仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，MTRR A66G的基因型頻率分布在腦梗死患者和健康人群中具有顯著性差異;MTRR A66G的基因多態(tài)性與腦梗死具有顯著相關(guān)性。另外，對MTRR A66G的不同基因型研究對象血漿中Hcy濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)無論是腦梗死患者還是正常人群MTRR A66G突變都會引起血漿中Hcy濃度的顯著升高，結(jié)果與之前報(bào)道一致，并且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MTRR A66G基因多態(tài)性與腦梗死有顯著相關(guān)性，提示MTRR A66G的突變可能推動(dòng)腦梗死的發(fā)生發(fā)展，作用機(jī)制可能是通過引起血漿中Hcy水平的上升。

維生素B12缺乏可以導(dǎo)致血漿中高水平的Hcy，進(jìn)而增加腦梗死發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，另有資料認(rèn)為中高劑量的維生素B12與腦血管病之間無關(guān)聯(lián)[15，16]。本研究發(fā)現(xiàn)腦梗死患者血漿中維生素B12水平明顯降低，并且維生素B12和Hcy的水平呈顯著負(fù)相關(guān)。由此推斷維生素B12的缺乏很可能引起血漿中Hcy的上升，這與既往大部分研究均一致。另外本研究發(fā)現(xiàn)通過腺苷鈷胺(又名輔酶維生素B12)干預(yù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)服用腺苷鈷胺可明顯降低腦梗死患者血漿中的Hcy水平，說明維生素B12缺乏可能是Hcy水平升高和腦梗死發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，日?？诜佘这挵房梢宰鳛轭A(yù)防和輔助治療腦梗死的方法。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，高Hcy水平是腦梗死發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，可作為診斷和治療的靶點(diǎn)。通過對患者遺傳背景的檢測，可針對性采取預(yù)防或治療方案，以減少腦梗死的發(fā)生，提高其治療效果。

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