李佳佳 鄭文麗 張華潭 李春花

[摘要] 目的 研究葶藶生脈方中黃芪、麥冬皂苷的含量測(cè)定方法，并以其含量為指標(biāo)優(yōu)選黃芪、麥冬的最佳提取工藝。 方法 選用以香草醛-冰醋酸-高氯酸為顯色劑，紫外分光光度法測(cè)定總皂苷的含量。采用正交試驗(yàn)法，以總皂苷的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間對(duì)提取工藝的影響，優(yōu)選黃芪、麥冬的最佳提取工藝。 結(jié)果 本研究中黃芪甲苷在8.88～44.40 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性試驗(yàn)的RSD值均≤1.19%，平均加樣回收率為101.78%，RSD值為1.85%（n = 9）。最佳提取工藝：8倍量80%的乙醇回流提取2次，每次2 h。 結(jié)論 該方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可作為葶藶生脈方中黃芪、麥冬皂苷質(zhì)量控制的方法。

[關(guān)鍵詞] 黃芪；麥冬；總皂苷；葶藶生脈方；提取工藝；正交試驗(yàn)

[中圖分類號(hào)] R284.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）02（c）-0128-04

Extraction and content determination of total saponins from Astragali Radix and Ophiopogonis Radix in Tingli Shengmai Decoction

LI Jiajia1 ZHENG Wenli2 ZHANG Huatan3 LI Chunhua4

1.Grduate School， Hebei University of Chinese Medicine， Hebei Province， Shijiazhuang 050090， China； 2.Department of Pharmacy， Shijiazhuang Second Hospital， Hebei Province， Shijiazhuang 050051， China； 3.Shijiazhuang Keren Pharmaceutical Technology Co.， Ltd， Hebei Province， Shijiazhuang 050035， China； 4.College of Pharmacy， Hebei University of Chinese Medicine， Hebei Province， Shijiazhuang 050200， China

[Abstract] Objective To study the content determination method of total saponins from Astragali Radix and Ophiopogonis Radix in Tingli Shengmai Decoction， and to optimize the optimum extraction process of Astragali Radix and Ophiopogonis Radix taking the contents as indices. Methods The vanillic aldehyde-glacial acetic acid-perchloric acid was selected as color developing agent， and the contents of total saponins were detected by ultraviolet spectrophotometry. By using orthogonal experiment， taking the contents of total saponins as indices， the effects of ethanol concentration， solid-liquid ratio and extraction duration for the extraction process were investigated， so as to optimize the optimum extraction process of Astragali Radix and Ophiopogonis Radix. Results In this study， astragaloside Ⅳ showed a good linear relationship within the range of 8.88-44.40 μg， all the RSD values of degree of precision， stability and repeatability experiments were ≤1.19%， the average recovery rate was 101.78%， RSD was 1.85% （n = 9）. The optimum extraction process： reflux extraction of 8 times amount of 80% ethanol was taken for 2 times， once 2 h. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible， which can be used as a method for the quality control of Astragali Radix and Ophiopogonis Radix in Tingli Shengmai Decoction

[Key words] Astragali Radix； Ophiopogonis Radix； Total saponins； Tingli Shengmai Decoction； Extraction process； Orthogonal experiment

葶藶生脈方是全國名老中醫(yī)邢月朋治療氣虛血瘀、陽虛水停型充血性心力衰竭（CHF）的經(jīng)驗(yàn)方，該方是由葶藶子、黃芪、麥冬、紅參、五味子、桂枝、茯苓、白術(shù)、豬苓、澤瀉、丹參、紅花、川芎組成，被列為國家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目。為將葶藶生脈方開發(fā)為現(xiàn)代制劑，我們探索適于方中黃芪、麥冬工業(yè)生產(chǎn)的工藝參數(shù)。方中黃芪、麥冬含有皂苷類成分，且均為有效成分?，F(xiàn)代藥理研究已證實(shí)：黃芪皂苷有強(qiáng)心作用，尤以黃芪甲苷具有明顯的正性肌力作用，可以改善心臟收縮和舒張功能[1-4]；麥冬皂苷對(duì)心肌細(xì)胞缺氧再給氧損傷具有保護(hù)作用[5-6]。文獻(xiàn)中多為黃芪、麥冬單味藥材的提取研究[7-10]，本研究將對(duì)黃芪、麥冬藥對(duì)進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化，為實(shí)際生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TU-1900紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；電子天平（天津天平儀器有限公司，TD200/型）；分析天平（上海精科儀器廠，TG328B型）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ-100E型）；立式電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，DGF-4A型）；有機(jī)系（0.22 μm）微孔濾膜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，RE-52型）；調(diào)溫型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

黃芪、麥冬藥材購于石家莊樂仁堂，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院侯芳潔講師鑒定符合2015版《中國藥典》一部相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。黃芪甲苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110781-200613）；甲醇（色譜純，批號(hào)：A2005-0001）購于美國Grace公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸、乙醇、正丁醇、氫氧化鈉等均為分析純，雙蒸水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥的黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，置5 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容，備用。得黃芪甲苷的濃度為0.4442 mg/mL。

2.2 供試品溶液的制備

根據(jù)組方配比，稱取黃芪30 g；麥冬10 g ；黃芪30 g+麥冬10 g；分別加入6倍量80%乙醇，回流提取2次，每次2 h。合并提取液，分別減壓回收乙醇144、48、192 mL。精密移取提取液5 mL，用水飽和正丁醇振搖萃取3次，每次7.5 mL，合并正丁醇層，后用0.1 mol/L的NaOH溶液洗滌正丁醇層2次，每次10 mL，蒸干回收正丁醇層，用甲醇溶解，置10 mL容量瓶，定容。精密吸取一定量的溶液，水浴蒸干，甲醇溶解，置25 mL容量瓶，定容，使每組溶液所含總生藥量為0.02 g/mL[11-12]。

2.3 檢測(cè)波長的確定

精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.6 mL，供試品溶液分別1 mL至具塞試管中，水浴揮干，分別精密加入新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸0.2 mL，高氯酸0.8 mL，于60℃水浴加熱15 min，取出立即冰浴5 min，加入5 mL冰醋酸。隨行試劑為空白試劑，在350～800 nm處掃描。見圖1。結(jié)果顯示：對(duì)照品和供試品在470 nm處有最大吸收。樣品的測(cè)定結(jié)果以黃芪甲苷為基準(zhǔn)來測(cè)定黃芪、麥冬總皂苷的含量。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別吸取上述黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，置5個(gè)具塞試管中，水浴揮干，按照“2.3”項(xiàng)下方法，在470 nm出測(cè)定吸收值，以含量（M，mg）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：A = 13.6149 M - 0.0115，r = 0.9998（n = 5），線性范圍為8.88～44.40 μg。結(jié)果表明，在線性范圍內(nèi)黃芪甲苷的含量與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液6份，每份0.6 mL，按照“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定在470 nm處的吸收值，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示RSD值為0.44%（n = 6），表明該儀器精密度較好。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取黃芪30 g、麥冬10 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行取6份，每份1 mL，置具塞試管中，按照“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定在470 nm處的吸收值，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示RSD值為0.13%（n = 6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取黃芪甲苷0.6 mL，“2.4.3”項(xiàng)樣品溶液1 mL，置具塞試管中，按照“2.3”項(xiàng)下方法，分別于0、5、10、15、20、30 min測(cè)定在470 nm處的吸收值，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示RSD值為1.19%，表明標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液顯色后在30 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取已知含量的供試品溶液9份于10 mL容量瓶中，3份為一組，加入對(duì)照品溶液0.051、0.103、0.152 mL，甲醇定容，按照“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定在470 nm處的吸收值，計(jì)算RSD值。計(jì)算黃芪甲苷平均加樣回收率分別為101.78%，RSD為1.85%（n = 9）。見表1。

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)選黃芪、麥冬提取工藝

2.5.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 通過查閱大量文獻(xiàn)，確定考察因素[13-16]，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以乙醇用量（A）、乙醇濃度（B）、提取時(shí)間（C）為考察因素，以總皂苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定總皂苷含量，從而確定黃芪、麥冬總皂苷提取的最佳工藝，因素水平見表2，正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表3，方差分析表見表4。

2.5.2 最佳提取工藝的確定 從表2和表3可知：根據(jù)極差的大小，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響順序?yàn)锽>C>A，即：乙醇濃度>提取時(shí)間>乙醇用量，方差結(jié)果顯示，乙醇濃度對(duì)提取工藝具有顯著性影響，而乙醇用量與提取時(shí)間對(duì)該工藝無顯著影響。結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)果最佳提取工藝為A3B2C3。即為10倍量80%乙醇，提取2次，每次2 h。根據(jù)表2可知乙醇用量為次要影響因素，因此出于對(duì)資源節(jié)約、生產(chǎn)實(shí)際等方面的需要，確定乙醇的用量為8倍量。

2.5.3 最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方規(guī)定量稱取黃芪、麥冬藥材，共3份，依據(jù)確定的最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果總皂苷的含量分別是7.036、7.235、7.195 mg/g，均比正交試驗(yàn)中的9組高，表明該研究確定的工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

比色法是測(cè)定總皂苷含量的經(jīng)典方法[17-20]。常用的有香草醛-冰醋酸-高氯酸、香草醛-濃硫酸以及高氯酸三種顯色方法[21]。本研究就曾通過比較三種方法的優(yōu)劣，選擇香草醛-冰醋酸-高氯酸為最佳的顯色劑。原因是香草醛-濃硫酸法顯色不穩(wěn)定，重現(xiàn)性差，測(cè)定數(shù)據(jù)誤差大，所以不能用于定量分析。而以高氯酸為顯色劑時(shí)，黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液最大吸收波長與黃芪麥冬提取液的最大吸收波長相差很多。香草醛-冰醋酸-高氯酸法，反應(yīng)靈敏，黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液與黃芪麥冬提取液的在470 nm處都有較強(qiáng)吸收，且重現(xiàn)性良好，因此選用此種顯色劑和黃芪甲苷為標(biāo)準(zhǔn)品來測(cè)定總皂苷的含量。

總皂苷采用比色法進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，對(duì)所需試劑的溫度及時(shí)間對(duì)其影響較大[22]。如本研究中顯色劑使用時(shí)應(yīng)該新鮮配制，因?yàn)橄悴萑┤菀妆谎趸饾u分解，使得空白溶液顏色加深，所以在水浴過后30 min之內(nèi)完成對(duì)總皂苷的含量測(cè)定，以免影響測(cè)定結(jié)果；其反應(yīng)溫度應(yīng)控制在60℃，當(dāng)溫度過高且長時(shí)間加熱時(shí)，可能會(huì)有多糖類成分造成干擾；這些因素都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生誤差，因此這一過程操作應(yīng)格外注意。

用水飽和的正丁醇萃取為了使其吸濕能力下降，萃取時(shí)不會(huì)將水中的化合物一并吸附，分層效果好，可防止萃取過程中產(chǎn)生的乳化現(xiàn)象，可以縮短萃取時(shí)間，提高萃取效率，后用0.1 mol/L的NaOH洗滌正丁醇層是用堿皂化反應(yīng)不完全的酯類生成鈉鹽而易溶于水。

香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色原理是高氯酸使苷元的酚羥基氧化為羧基，增加一個(gè)雙鍵結(jié)構(gòu)，再經(jīng)雙鍵位移，雙分子縮合等反應(yīng)生成共軛雙鍵系統(tǒng)，又在酸的作用下形成陽碳離子鹽而顯色。

本研究采用比色法測(cè)定皂苷的總含量，方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確易行，為葶藶生脈方中黃芪、麥冬皂苷的定量分析提供了快速、有效的分析方法。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 仝欣.黃芪主要活性成分的藥理作用[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22（5）：1426-1429.

[2] 吳焱，楊振宇，曾濤.黃芪皂苷甲的心血管藥理作用研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥綜述，2010，31（17）：308-310.

[3] 尤良震，林逸軒，方朝暉，等.黃芪甲苷治療糖尿病及其并發(fā)癥藥理作用研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2017，42（24）：4700-4706.

[4] 曹玉冰.黃芪甲苷的藥理作用及其機(jī)制的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2017，32（5）：954-960.

[5] 于曉文，杜鴻志，孫立，等.麥冬皂苷藥理作用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)進(jìn)展，2014，38（4）：279-284.

[6] 李瓊，邱飛，徐先祥.短葶山麥冬皂苷C藥理作用研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2014，26（8）：1-2.

[7] 杜學(xué)勤，趙正保.黃芪中黃芪皂苷的提取分離工藝研究[J].中成藥，2008，30（7）：1066-1068.

[8] 周躍華，徐德生，馮怡，等.麥冬總皂苷提取工藝的研究[J].中草藥，2002，33（12）：23-25.

[9] 王春怡，李衛(wèi)民，高英.大孔吸附樹脂精制黃芪總皂苷工藝研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，19（9）：44-47.

[10] 梅雪，張坤，李彪，等.麥冬皂苷的提取分離及含量測(cè)定方法研究概述[J].中國藥房，2015，26（27）：3883-3886.

[11] 許敏，高英，李衛(wèi)民.麥冬總皂苷含量測(cè)定方法研究[J].臨床醫(yī)藥時(shí)間，2010，19（5B）：596-597.

[12] 岳磊，朱丹妮，嚴(yán)永清，等.生脈散制劑中總皂苷含量的測(cè)定[J].中成藥，2004，26（11）：897-900.

[13] 錢斯日古楞，王紅英，金鳳燮.正交設(shè)計(jì)研究麥冬皂苷提取工藝[J].中成藥，2005，27（5）：594-595.

[14] 錢大瑋，朱玲英，段金廒，等.用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化黃芪皂苷提取工藝[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2004，10（6）：1-2.

[15] 王玲麗，郭艷茹，鄧梅，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)選黃芪中黃芪甲苷提取工藝[J].分子植物育種，2017，15（4）：1436-1440.

[16] 葉迎，包強(qiáng)，王瑞海，等.甘肅黃芪和紅芪中總皂苷含量測(cè)定對(duì)比研究[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2016，9（10）：1197-1203.

[17] 閆嵩，任偉超，劉振鵬，等.黃芪多糖、皂苷、黃酮含量之間的相關(guān)性分析[J].西部中醫(yī)藥，2016，29（12）：29-31.

[18] 杜金鳳，宋鑒達(dá)，朱傳翔，等.比色法測(cè)定人參保健飲料中人參總皂苷含量[J].現(xiàn)代食品，2017（11）：79-80.

[19] 陳朝.三七及其制劑中皂苷類成分含量測(cè)定方法研究概述[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2017，23（5）：49-53.

[20] 郭棟.復(fù)方保健產(chǎn)品中總皂苷和紅景天苷的檢測(cè)及質(zhì)量控制研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2015.

[21] 王曉琳，張平.黃芪飲片與黃芪配方顆粒有效成分含量比較[J].西部中醫(yī)藥，2017，30（2）：25-27.

[22] 高偉，李遵，段偉華，等.比色法測(cè)定木通屬植物總皂苷含量的研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，35（10）：134-137，146.

（收稿日期：2017-12-19 本文編輯：張瑜杰）