薛生玲， 江 敏， 常嘉琪， 段妍雯， 陳 濤， 郝 宇， 張 芬， 孫 勃

(1.四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院，四川 成都 611130； 2.浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院園藝系，浙江 杭州 310058)

芥藍(Brassicaoleraceavar.alboglabra)又名芥蘭、蓋菜等，染色體數(shù)2n=18，是十字花科蕓薹屬蔬菜[1]，起源于中國南部，在廣東、廣西、福建和臺灣等地區(qū)廣泛栽培，以肥嫩的花薹、嫩葉為主要食用器官[2]。芥藍有豐富的種質(zhì)資源和悠久的栽培歷史，由于其含有豐富的維生素C、類胡蘿卜素、芥子油苷和多酚等營養(yǎng)物質(zhì)，而深受消費者的喜愛和歡迎[3]。

牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶(GGPPS)作為類胡蘿卜素生物合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶，可將一分子的二甲基丙烯基二磷酸(DMAPP)與三分子的異戊烯基二磷酸(IPP)縮合生成類胡蘿卜素生物合成代謝途徑中最直接的前體物質(zhì)——牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(Geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)[4]。Ukibe等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在啤酒酵母中過量表達GGPPS基因，不僅GGPP表達量增加，類胡蘿卜素含量也隨之增加。此外，GGPP也是葉綠素、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)、維生素K等的前體物質(zhì)[6-7]。魏攀等[8]利用RNAi技術(shù)對煙草中NtGGPPS1進行特異性沉默，植株呈現(xiàn)變矮、花期延遲、質(zhì)體色素含量降低等現(xiàn)象，結(jié)果表明NtGGPPS1可能影響葉綠素和植株生長調(diào)節(jié)相關(guān)的萜類物質(zhì)的合成。目前，已從擬南芥[9]、番茄[10]、煙草[11]和銀杏[12]等多種植物中成功分離出GGPPS基因，然而，芥藍中尚未有該基因的報道。

鑒于GGPPS基因?qū)︻惡}卜素生物合成的影響及在植物生長發(fā)育過程中的作用，本試驗擬以芥藍葉片為材料，采用RT-PCR方法，克隆BoaGGPPS1基因的CDS序列，對該序列進行生物信息學分析；利用半定量PCR對BoaGGPPS1基因在芥藍不同器官中的表達量進行分析；構(gòu)建原核表達載體，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌體內(nèi)，誘導(dǎo)表達。為進一步研究BoaGGPPS1基因的生物學功能及該基因所編碼的酶在調(diào)控芥藍中類胡蘿卜素的含量奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為芥藍‘明豐香菇′，待幼苗長出3～4片真葉，剪取其新鮮葉片提取總RNA，用于基因克隆。將成熟期芥藍的根系、花薹、葉柄、葉片、花序、果莢和幼果分別取樣并提取總RNA，用于基因表達分析。

1.2 試驗試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、DNA分子量標準DL2000、Taq酶、蛋白分子量標準(6 500～200 000) 均購于大連寶生物公司，DNA膠回收試劑盒、異丙基硫代半乳糖苷、氨芐青霉素均購于上海生物工程有限公司，DNA高保真聚合酶、克隆載體pEASY-Blunt、原核表達載體pEASY-Blunt E1、BL21 (DE3)表達感受態(tài)細胞、Trans1-T1克隆感受態(tài)細胞均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 總RNA提取與cDNA合成

采用Chen等[13]改良的CTAB法提取芥藍葉片的總RNA，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA合成，并將所得產(chǎn)物于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因克隆

根據(jù)NCBI已公開的十字花科植物白菜、結(jié)球甘藍等GGPPS基因序列，為BoaGGPPS1基因設(shè)計特異性引物(表1)，并合成。PCR擴增體系共40.0 μl：模板1.6 μl，引物(10.0 μmol/L)各1.6 μl，Buffer 8.0 μl，dNTPs (2.5 mmol/L) 3.2 μl，Taq酶0.8 μl，ddH2O 23.2 μl。PCR擴增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，54 ℃ 20 s，72 ℃ 18 s，40次循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，最終于12 ℃保存。將產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠(1.0%)電泳檢測后，用上海生物工程有限公司的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化回收目的基因BoaGGPPS1片段。將回收產(chǎn)物與pEASY-Blunt克隆載體連接，轉(zhuǎn)至大腸桿菌Trans1-T1中，涂板后過夜培養(yǎng)，經(jīng)挑菌、搖菌等操作后，進行菌落PCR篩選，并測序。

1.5 生物信息學分析

利用NCBI-ORF、ExPASy在線軟件計算GGPPS蛋白的分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)，利用TMHMM軟件分析和推測蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)，利用SignalP4.0 Serve對蛋白質(zhì)進行信號肽分析，利用SSpro 4.0對芥藍BoaGGPPS1蛋白進行二級結(jié)構(gòu)分析，利用WoLF PSORT軟件進行亞細胞定位，利用NCBI-BLAST及DNAMAN軟件進行序列同源性比對及保守結(jié)構(gòu)域分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[14-15]。

表1芥藍BoaGGPPS1基因克隆及表達所用引物

Table1PrimersequencesforcloningandexpressionofBoaGGPPS1gene

引物 引物序列(5′→3′)GGPPS1?FATGGCTTCTTCAGTGACTCTAGGTTCATGGPPS1?RTCAGTTCTGTCTATTGGCAATGTAGTGGPPS1?semiRT?FTCGGCGACGAGCTCCGACGGPPS1?semiRT?RCGGATACGTCAGCTTATCAGCGAT?CAAAβ?actin?FCCACCAATCTTGTACACATCCβ?actin?RAGACCACCAAGTACTACTGCAC

1.6 基因表達分析

根據(jù)已分離的BoaGGPPS1基因堿基序列，設(shè)計特異性半定量引物，內(nèi)參基因β-actin引物參照文獻[16](表1)。

以成熟期芥藍不同器官的cDNA為模板，對BoaGGPPS1基因表達量進行半定量分析。PCR體系(20 μl)為：Taq酶10 μl，上、下游引物各1 μl，模板1 μl，ddH2O 7 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用Gel-Pro軟件對電泳圖進行光密度分析?；虮磉_水平用相對于β-actin基因表達量的百分數(shù)值表示。試驗設(shè)置3次重復(fù)，數(shù)據(jù)用Excel 2013軟件進行整理分析。

1.7 原核表達載體構(gòu)建及表達

利用在線軟件Rare Codon Calculator(RaCC)對芥藍BoaGGPPS1序列進行稀有密碼子分析。將原核表達載體pEASY-Blunt E1與純化回收的BoaGGPPS1基因片段進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)至大腸桿菌Trans1-T1體內(nèi)，轉(zhuǎn)化及篩選方法按1.4的方法，提取篩選出的重組質(zhì)粒pEASY-Blunt E1-BoaGGPPS1(堿裂解法)，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達感受態(tài)BL21(DE3)中，挑菌后擴大培養(yǎng)至OD值為 0.6～0.8，在37 ℃、1 mmol/L的IPTG條件下，誘導(dǎo)表達8 h后提取蛋白質(zhì)，最后將待上樣樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍R250染色和脫色處理后，觀察目的蛋白在大腸桿菌內(nèi)的表達情況和存在形式[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥藍BoaGGPPS1基因的克隆

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴增產(chǎn)物后，得到一條長度約為1 100 bp的特異性條帶，該條帶大小與預(yù)測片段一致。陽性克隆測序后，得到一條長1 113 bp的序列(圖1)，并將其命名為BoaGGPPS1。

2.2 生物信息學分析

利用NCBI-ORF、ExPASy軟件對芥藍BoaGGPPS1基因所編碼的蛋白質(zhì)進行理化分析。試驗結(jié)果表明，BoaGGPPS1蛋白由370個氨基酸殘基組成，共5 634個原子，分子式為C1741H2845N491O543S14，理論分子量為39 790，等電點(pI)為6.07，為弱酸性蛋白質(zhì)，不穩(wěn)定指數(shù)為45.77，屬不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；脂肪指數(shù)為99.68，平均親水系數(shù)為-0.05。利用TMHMM分析發(fā)現(xiàn)BoaGGPPS1蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于膜外在蛋白；利用SignalP分析發(fā)現(xiàn)BoaGGPPS1蛋白不存在信號肽結(jié)構(gòu)，為非分泌蛋白。利用SSpro 4.0對BoaGGPPS1蛋白進行二級結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋(H)占60.6%，β折疊(E)占2.2%，無規(guī)則卷曲(C)占37.2%。經(jīng)WoLF PSORT分析，BoaGGPPS1位于葉綠體。

利用ScanProsite工具預(yù)測，BoaGGPPS1蛋白含2個多聚異戊二烯合成酶特征結(jié)構(gòu)域“152LIhDDlpcmDnddlRRG168”和“288IGllFQVvDDIlD300”；依據(jù)NCBI-CDD保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)BoaGGPPS1蛋白屬于異戊二烯合成酶家族，含有底物結(jié)合袋、兩個富含天冬氨酸區(qū)域、底物-Mg2+結(jié)合位點、特異結(jié)構(gòu)域Trans_IPPS_HT、超家族Isoprenoid_Biosyn_C1等(圖2)。將芥藍BoaGGPPS1氨基酸序列與8種不同植物的GGPPS氨基酸序列分別進行兩兩比對分析，BoaGGPPS1的氨基酸序列與結(jié)球甘藍(Brassicaoleraceavar.capitata)、白菜(Brassicarapa)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、葡萄(Vitisvinifera)、蒺藜狀苜蓿(Medicagotruncatula)、蘋果(Malusdomestica)、可可(Theobromacacao)、毛果楊(Populustrichocarpa)等的氨基酸序列一致性分別為98%、96%、86%、80%、74%、70%、70%、69%。對這9種植物的GGPPS蛋白氨基酸序列進行多序列比對，試驗結(jié)果表明，GGPPS蛋白N端高度不保守，而多肽鏈的中部和C端具有高度保守性(圖3)。

圖1 芥藍BoaGGPPS1基因CDS及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence of BoaGGPPS1 CDS and its deduced amino acids

圖2 芥藍BoaGGPPS1蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Conserved domain of BoaGGPPS1

BoaGGPPS1：芥藍，BocGGPPS：結(jié)球甘藍(XP_013596174.1)，BrGGPPS：白菜(XP_009141710.1)，AtGGPPS：擬南芥(NP_195399.1)，MdGGPPS：蘋果(AHA61556.1)，MtGGPPS：蒺藜狀苜蓿(XP_003629488.1)，PtGGPPS：毛果楊(XP_006383249.1)，TcGGPPS：可可(EOX91186.1)，VvGGPPS：葡萄(CAN78430.1)。圖3 GGPPS蛋白的氨基酸序列比對Fig.3 Alignment of amino acid sequences of GGPPS

將芥藍BoaGGPPS1蛋白與其他18種不同植物進行系統(tǒng)進化樹分析，采用鄰近法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，結(jié)果表明，該系統(tǒng)進化樹主要分為3支，第一支中十字花科的芥藍與其同科的結(jié)球甘藍、白菜、甘藍型油菜、山萮菜和擬南芥聚在一起，第二支中薔薇科的蘋果與水蜜桃聚在一起，豆科的蒺藜狀苜蓿單獨形成一個分支，說明同科植物GGPPS蛋白的同源性更高。在系統(tǒng)進化樹中，芥藍BoaGGPPS1與結(jié)球甘藍BocGGPPS的親緣關(guān)系最近。

2.3 BaGGPPS1基因在芥藍器官中的表達

對BoaGGPPS1基因在成熟期芥藍各器官中的表達情況進行分析，結(jié)果表明，BoaGGPPS1基因在芥藍各器官中均有表達，但其表達量存在明顯差異。BoaGGPPS1基因在芥藍葉片中的表達量最高，果莢次之，隨后是花薹、葉柄、花序和幼果，根系中的表達量最低(圖5)。

圖4 19種不同植物GGPPS氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of GGPPS amino acid sequences of 19 different plants

圖5 BaGGPPS1基因在芥藍不同器官中的表達Fig.5 Expression of BaGGPPS1 in different organs of Brassica oleracea var. alboglabra

2.4 原核表達

對BoaGGPP1基因堿基序列進行稀有密碼子分析，結(jié)果顯示該序列稀有密碼子的出現(xiàn)頻率較低，且稀有密碼子非成串出現(xiàn)，因此選用大腸桿菌表達感受態(tài)細胞BL21(DE3)。

將回收純化的BoaGGPPS1基因片段與表達載體pEASY-Blunt E1進行25 ℃連接15 min，轉(zhuǎn)入克隆感受態(tài)中，經(jīng)陽性篩選、測序等檢測后，選擇構(gòu)建好的表達載體，進行重組質(zhì)粒提取，將提取的重組質(zhì)粒與空載分別轉(zhuǎn)入表達感受態(tài)細胞中，經(jīng)擴大培養(yǎng)、誘導(dǎo)等步驟后，提取總蛋白質(zhì)，用SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色檢測(圖6)，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒在BL21(DE3)中進行了表達，并在44 300附近具有特異性表達條帶，該結(jié)果與預(yù)測的39 790相一致。分離上清和沉淀中的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)在大腸桿菌中主要以包涵體的形式存在。

M:Protein marker(6 500～200 000); 1～4為總蛋白質(zhì)檢測; 5～6為上清液中蛋白質(zhì)檢測; 7～8為沉淀中蛋白質(zhì)檢測。1：未誘導(dǎo)空載; 2：誘導(dǎo)空載; 3：未誘導(dǎo)BL(DE3)(pEASY-Blunt E1-BoaGGPPS1); 4：誘導(dǎo)8 h的BL(DE3)(pEASY-Blunt E1-BoaGGPPS1); 5、7：未誘導(dǎo)BL(DE3)(pEASY-Blunt E1-BoaGGPPS1); 6、8：誘導(dǎo)8 h的BL(DE3)(pEASY-Blunt E1-BoaGGPPS1)。圖6 pEASY-Blunt E1-BoaGGPPS1在大腸桿菌中的表達Fig.6 Expression of pEASY-Blunt E1-BoaGGPPS1 protein in Escherichia coli

3 討 論

類胡蘿卜素作為自然界中廣泛存在的一種脂溶性異戊二烯類色素，具有參與光合調(diào)節(jié)、生物代謝和生長調(diào)節(jié)、營養(yǎng)作用、增強免疫力等豐富的生物學功能。本試驗成功分離出BoaGGPPS1基因的CDS,全長為1 113 bp，其編碼的蛋白酶BoaGGPPS1可能催化底物生成芥藍類胡蘿卜素生物合成途徑中的直接前體物質(zhì)。研究報道，GGPPS是多基因家族，同一植物中GGPPS蛋白家族的不同成員可能位于不同細胞器，并且同一GGPPS蛋白在不同植物中也可能位于不同細胞器[18]。在擬南芥中共發(fā)現(xiàn)12個GGPPS成員，通過亞細胞定位檢測，GGPPS蛋白位于線粒體、質(zhì)體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，煙草中NtGGPPS1位于質(zhì)體[8]，NtGGPPS3位于葉綠體和質(zhì)膜[19]。本試驗根據(jù)WoLF PSORT預(yù)測BoaGGPPS1蛋白可能位于葉綠體中，推測其主要參與MEP途徑的萜烯類化合物合成。

本試驗采用半定量PCR方法對BoaGGPPS1基因在芥藍不同器官中的表達情況進行分析，該基因在芥藍的各器官中均有表達，但其表達量存在明顯差異，說明該基因表達具有一定的組織特異性。結(jié)合BoaGGPPS1基因在芥藍葉片中的表達量最高，根系中表達量最低的現(xiàn)象，推測該基因可能參與了葉綠素、類胡蘿卜素和質(zhì)體醌等與光合作用相關(guān)萜類化合物的合成。

經(jīng)NCBI-CDD、序列比對等分析發(fā)現(xiàn)，BoaGGPPS1蛋白含有GGPPS酶家族的5個保守結(jié)構(gòu)域，表明BoaGGPPS1蛋白為該家族的一個成員。結(jié)果表明GGPPS基因家族不同成員的功能也有所不同，擬南芥中已分離出的12個GGPPSs成員中，AtGGPPS5可能是一個假基因，AtGGPPS12是非功能性的，且GGPPSs在擬南芥中的表達模式也存在明顯差異，只有AtGGPPS1和AtGGPPS11在所有器官和組織中均表達，屬于組成型表達，其他基因均呈現(xiàn)特異性表達[6]；煙草中已分離出5個GGPPSs成員中，其中NtGGPPS1和NtGGPPS2分別參與了赤霉素與葉綠素的生物合成[20]。本試驗?zāi)壳爸粡慕嫠{中分離得到BoaGGPPS1基因，將在后續(xù)的研究中繼續(xù)分離該基因家族的其他成員，并通過利用基因沉默及過表達等技術(shù)手段進一步研究其功能，為今后芥藍中類胡蘿卜素含量調(diào)控的研究奠定基礎(chǔ)。

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