覃信梅， 蔣水元， 韓 愈， 向巧彥， 李 虹， 甘金佳， 梁勇詩， 黃夕洋

(1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004； 2.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006； 3.廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541006)

羅漢果[Siraitiagrosvenorii(Swingle) C.Jeffrey]是單性、雌雄異株的葫蘆科羅漢果屬草質(zhì)藤本植物，具有清熱潤肺、止咳祛痰、潤腸通便等功效，是桂林兼具藥食兩用和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)的地方特色植物，主產(chǎn)于桂林的永福縣和臨桂縣[1-2]。羅漢果需雌花、雄花成功授粉后才能坐果，從果實(shí)中提取的有效成分甜苷V是甜度高、熱量低、安全無毒的天然甜味劑，是肥胖者和糖尿病患者理想的代用糖[3]。近年來，甜苷V作為新型食品甜味劑已被國內(nèi)外市場(chǎng)廣泛接受，需求量逐年增長，但由于成本較高，僅能在高端產(chǎn)品中使用，這成了制約羅漢果拓寬市場(chǎng)份額的主要問題。因此，為了提高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，促進(jìn)甜苷V在全球商品中的廣泛使用，產(chǎn)量高、甜苷V含量高、抗病性強(qiáng)等成為羅漢果品種培育的新目標(biāo)。

種質(zhì)資源為新品種培育提供材料來源，是開展種質(zhì)創(chuàng)新必不可少的基礎(chǔ)。本研究室一直重視且堅(jiān)持開展羅漢果不同種質(zhì)的收集、保存和選育，建立了羅漢果種質(zhì)資源遷地保護(hù)圃，保存有航天、無籽、野生和栽培4類特異種質(zhì)的優(yōu)良品種(系)。其中，航天早熟突變體和低甜苷含量突變體均是在2014-2016年羅漢果航天種子選育過程中首次發(fā)現(xiàn)的，該早熟雌株不僅可使果實(shí)提早15～20 d成熟，并且甜苷含量接近常規(guī)果實(shí)，還可有效提高桂林地區(qū)羅漢果露地種植一年兩熟的可操作性，增加采果批次，從而提高豐產(chǎn)的潛力。與常規(guī)果實(shí)相比，低甜苷含量突變體的果實(shí)雖然表現(xiàn)出過低的甜苷含量，但對(duì)研究甜苷Ⅴ代謝途徑調(diào)控機(jī)理而言，是非常好的材料，對(duì)今后培育高甜苷羅漢果品種具有重要的科學(xué)意義。三倍體無籽羅漢果具備豐產(chǎn)性強(qiáng)，甜苷Ⅴ含量高，不含種子或少種子等優(yōu)勢(shì)，是非常值得關(guān)注的種質(zhì)。羅漢果野生資源也是寶貴的育種材料，而且絕大多數(shù)野生羅漢果很難分辨雌雄，或需種植幾年才會(huì)開花結(jié)實(shí)，所以可區(qū)分雌雄的野生種質(zhì)對(duì)選育來說非常難得。本研究保存有已知雌雄的野生青皮果、紅毛果、冬瓜果以及在羅漢果育種研究中新收集到的湖南永州、廣西百色、柳州雅瑤鄉(xiāng)等地的野生資源，這些都為雜交育種和品種改良研究提供了寶貴的新材料。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性(ISSR)分子標(biāo)記技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速，在輔助育種方面具有可有效減少盲目性，縮短育種時(shí)間和周期的優(yōu)點(diǎn)。為充分利用航天、無籽、野生和栽培等羅漢果種質(zhì)，盡早選育出早熟、高產(chǎn)、高甜苷、高抗性或其他優(yōu)良性狀綜合一體的羅漢果新品種，本研究擬利用ISSR技術(shù)對(duì)21份羅漢果特異種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳背景差異分析及雜交優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)，構(gòu)建羅漢果種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜、UPGMA聚類圖，以期為今后羅漢果種質(zhì)資源的鑒定，新品種的培育以及知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集羅漢果不同特異種質(zhì)的新鮮葉片，用硅膠密封保存后帶回實(shí)驗(yàn)室備用。試驗(yàn)材料具體來源如表1顯示。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和質(zhì)量檢測(cè) 采用改良CTAB(2×)法[4]提取羅漢果干燥葉片的總DNA，保存于-20 ℃的冰箱中備用。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，Nano Drop TM/ND-2000C儀檢測(cè)DNA濃度和純度。

1.2.2 PCR-ISSR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序 反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照周俊亞等[5]方法，反應(yīng)體系中的ISSR引物為0.5 μmol/L，模板DNA約50 ng，其他按照TaKaRa公司EmeraldAmp? Max PCR Master Mix的說明書操作。在PCR儀(BIO-RAD公司產(chǎn)品)上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。退火溫度因引物的擴(kuò)增效果不同而稍有調(diào)整，具體見表2。

1.2.3 電泳檢測(cè) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后在UVP凝膠成像系統(tǒng)中顯影、拍照。

表1羅漢果特異種質(zhì)資源

Table1ThespecialgermplasmresourcesofSiraitiagrosvenorii

編號(hào) 品種雌雄 采集地S1航天早熟突變體♀廣西植物研究所種質(zhì)圃S2航天甜苷突變體♀廣西植物研究所種質(zhì)圃S3航天優(yōu)良雄株♂廣西植物研究所種質(zhì)圃S4無籽優(yōu)良株系1♀廣西植物研究所種質(zhì)圃S5無籽優(yōu)良株系2♀廣西植物研究所種質(zhì)圃S6野生紅毛果♀桂林永?？h龍江鄉(xiāng)S7野生紅毛果♂桂林永?？h龍江鄉(xiāng)S8野生青皮果♀桂林永?？h龍江鄉(xiāng)S9野生♂桂林永?？h龍江鄉(xiāng)S10野生爆棚果-桂林永?？h龍江鄉(xiāng)S11野生-桂林永?？h保安鄉(xiāng)S12野生-桂林興安縣貓兒山S13野生♂桂林興安縣貓兒山S14野生-桂林興安縣溶江鎮(zhèn)S15野生-桂林臨桂縣茶洞鄉(xiāng)S16野生冬瓜果♀柳州融安縣雅瑤鄉(xiāng)S17野生-柳州金秀縣長垌鄉(xiāng)平辦屯S18野生♀湖南永州雙牌縣茶林鎮(zhèn)S19野生-百色泮水鄉(xiāng)S20栽培優(yōu)良雌株♀廣西植物研究所種質(zhì)圃S21栽培優(yōu)良雄株♂廣西植物研究所種質(zhì)圃

-:未知雌雄，即該品種羅漢果沒有開花結(jié)果，故還不清楚是雄株還是雌株；♀：雌株；♂：雄株。

1.2.4 引物篩選 以21份羅漢果DNA為模板，對(duì)100條ISSR通用引物進(jìn)行篩選，從中篩選出19條擴(kuò)增重復(fù)性好、穩(wěn)定、條帶清晰且具有多態(tài)性的引物，引物名稱和序列如表2顯示。

1.2.5 ISSR數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 ISSR為顯性標(biāo)記，同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在相同的遷移位置上有擴(kuò)增條帶的記錄為1，無擴(kuò)增條帶的記錄為0，構(gòu)建0和1的原始矩陣。利用Gen AlEx6.5軟件[6-7]計(jì)算遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離[8]，用NTSYSpc Version 2.10 e[9]軟件構(gòu)建UPGMA聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 檢測(cè)

由瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果可知，總DNA條帶亮度高、集中、清晰，21個(gè)DNA的λ260/280為2.00～2.17，λ260/230為1.77～2.04，DNA濃度為 1 083.0～4 003.3 ng/μl。可見，本試驗(yàn)提取的羅漢果總DNA具有較高的完整性，濃度高，質(zhì)量好，可用于后續(xù)研究。

2.2 遺傳差異分析

2.2.1 引物多態(tài)性分析 從100條ISSR引物中選出19條多態(tài)性理想的引物，各引物的擴(kuò)增總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)和多態(tài)百分比如表2顯示。19條引物共擴(kuò)增出212個(gè)條帶，其中155條具有多態(tài)性，多態(tài)性條帶的百分比為73.11%。不同引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)為 5～17條，多態(tài)性條帶數(shù)為 3～16條，具有較高的多態(tài)百分比 42.86%～100.00%。其中引物889的擴(kuò)增圖譜如圖1顯示。

表219條簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性(ISSR)引物擴(kuò)增條帶數(shù)與多態(tài)性比率

Table2Polymorphismrateandthenumberofbandsamplifiedby19inter-simplesequencerepeat(ISSR)primers

引物序列退火溫度(℃)擴(kuò)增總條帶數(shù)多態(tài)性條帶數(shù)多態(tài)性條帶百分比(%)808(AG)8C5212866．67810(GA)8T528562．50811(GA)8C529555．56826(AC)8C525360．00830(TG)8G5210990．00834(AG)8YT5210660．00836(AG)8YA5010880．00840(GA)8YT50161168．75841(GA)8YC5010770．00842(GA)8YG5013969．23856(AC)8YA52171482．35859(TG)8RC50141392．86861(ACC)6527342．86868(GAA)6529777．78873(GACA)4521616100．00888BDB(CA)7529555．56889DBD(AC)75213969．23890VHV(GT)75212866．67891HVH(TG)75212975．00

2.2.2 DNA指紋圖譜構(gòu)建 為了更好地在分子水平上了解羅漢果各特異種質(zhì)的品種(系)特性和差異，以便為今后在新品種申請(qǐng)、保護(hù)等方面提供理論和技術(shù)指導(dǎo)，本研究在19個(gè)ISSR多態(tài)性引物擴(kuò)增圖譜中，選擇841、856、868、873和891共5個(gè)引物構(gòu)建可區(qū)分21個(gè)種質(zhì)的DNA指紋圖譜。特征條帶是進(jìn)行種質(zhì)或類型鑒別的重要指標(biāo)，21個(gè)種質(zhì)的特征帶位置具體如表3顯示。

M：Marker；S1～S21見表1。圖1 引物 889 對(duì)21份材料的ISSR擴(kuò)增圖譜Fig.1 ISSR profiles amplified from DNA of 21 individuals using primer 889

表3ISSR指紋圖譜鑒別羅漢果特異種質(zhì)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

Table3TheidentificationresultsofspecialgermplasmusingISSRfingerprinting

引物號(hào)特征條帶位置(bp)特征帶 可鑒別的種質(zhì)編號(hào)841500無S7、S13750有S1、S5、S15、S20800有S4、S8、S9、S21850無S3、S4、S7、S10、S12、S13、S17、S18、S191200有S2、S3、S4、S5、S7、S9、S161300有S1、S3、S4、S5、S6、S15、S16、S20、S21856700有S3、S8、S9、S11、S14、S18、S191200有S1、S2、S4、S5、S9、S11、S15、S20、S211250有S9868350無S1、S5、S8、S16、S17、S18、S20480有S6、S8800有S8、S11、S15900無S5、S13、S181400無S4、S18、S21873350有S7、S14、S15400有S7、S14510有S3、S8、S14、S15、S17610有S6、S8、S10、S11、S13、S14、S15、S17、S18、S20700有S4、S12、S15、S16、S17、S18、S19、S20800有S2、S7、S9、S12、S13850有S2、S8、S12900有S1、S2、S3、S7、S10、S12、S13、S161180有S2、S8、S12、S181200有S1、S7、S181400無S7、S13、S17、S181550有S1、S2、S3、S17891480無S19710有S18750無S101000有S181450無S17、S18

2.2.3 遺傳相似性系數(shù)、遺傳距離及聚類分析 21份材料間的遺傳相似性系數(shù)為 0.656～0.896，其中S7與S17間的遺傳相似性系數(shù)最低(0.656)，遺傳距離最高(0.422)，而S15與S20間的遺傳相似性系數(shù)最高(0.896)，遺傳距離最小(0.110)。

21份材料的UPGMA聚類圖(圖2)顯示，S15(野生，桂林臨桂縣茶洞鄉(xiāng))與S20(栽培優(yōu)良雌株)最先聚在一起，具有最高的遺傳相似性系數(shù)，可推測(cè)該栽培優(yōu)良雌株由臨桂縣茶洞鄉(xiāng)的野生種質(zhì)選育或雜交而來。其次，具有較高相似性系數(shù)的是S1(航天早熟突變體♀)與S16(野生冬瓜果♀，柳州融安縣雅瑤鄉(xiāng))、S10(野生爆棚果，桂林永?？h龍江鄉(xiāng))與S11(野生，桂林永福縣保安鄉(xiāng))、S2(航天甜苷突變體♀)與S3(航天優(yōu)良雄株)。野生種質(zhì)S10與S11以及航天種質(zhì)S2與S3是由于區(qū)域相近或來源相同而聚在一起的，而同為航天誘變種質(zhì)的S1與S2、S3的遺傳相似性系數(shù)均低于其與S16，說明S1與S2、S3產(chǎn)生了一定的遺傳突變和分化，同時(shí)也說明S1突變體在DNA或性狀上與S16更接近。另外，2個(gè)種質(zhì)聚在一起的還有由多倍體誘變選育出來的S4(無籽優(yōu)良♀株系1)與S5(無籽優(yōu)良♀株系2)、S13(野生♂，桂林興安縣貓兒山)與S14(野生，桂林興安縣溶江鎮(zhèn))、S7(野生紅毛果♂，桂林永?？h龍江鄉(xiāng))與S19(野生，百色泮水鄉(xiāng))。

在相似性系數(shù)為0.795處，21份羅漢果特異種質(zhì)可以分為5類，第一類為S1、S16、S6、S15、S20、S10、S11、S21、S4、S5、S8、S13、S14，第二類為S2、S3、S12、S7、S19，第三類為S9，第四類為S18，第五類為S17。整體上看，在桂林地區(qū)采集的大部分野生種質(zhì)聚在第一類，只有S12、S7、S19聚在第二類，而S9、S18、S17則各自單獨(dú)一支為第三類、第四類和第五類，與其他材料相距較遠(yuǎn)。新采集的野生種質(zhì)柳州融安縣雅瑤鄉(xiāng)S16，由于緊鄰桂林永福龍江鄉(xiāng)，所以它也聚在第一類，而S19、S18、S17由于地理位置與桂林相距較遠(yuǎn)，所以基本上與桂林地區(qū)種質(zhì)的遺傳差異較大，但S19與桂林野生種質(zhì)的相似性系數(shù)較大，極有可能是從桂林地區(qū)擴(kuò)散出去的。本研究對(duì)羅漢果種質(zhì)的遺傳距離及地理分布的研究結(jié)果與前人的結(jié)果[10]一致，即野生種質(zhì)間的遺傳距離與地理距離有相關(guān)性。

從雌雄株系的角度看，航天、無籽、栽培和野生種質(zhì)的雌株大多都聚在第一類，只有S2和S18分別在第二類和第四類。雄株S21和S13聚在第一類，雄株S3和S7聚在第二類，雄株S9在第三類。

圖2 21個(gè)樣本間基于遺傳相似性系數(shù)的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram for 21 individuals based on genetic similarity coefficients

2.3 雜交優(yōu)勢(shì)親本的預(yù)測(cè)

羅漢果是異花授粉植物，通過選擇優(yōu)良的親本雜交可使果實(shí)或子代獲得理想的性狀。雜種優(yōu)勢(shì)與遺傳差異大小有較強(qiáng)的相關(guān)性，因而遺傳距離可作為雜交親本選配的一個(gè)重要參數(shù)，選擇遺傳距離較遠(yuǎn)且差異較大的親本雜交，可能會(huì)獲得較好的效果[11]。根據(jù)21份羅漢果材料中不同雌×雄的遺傳距離，以及羅漢果雜交后代具有母性遺傳的特征[12-13]，在S1、S4、S5、S6、S8、S16、S18、S20的8個(gè)雌株雜交組合中，優(yōu)先關(guān)注遺傳差異最大的前2個(gè)組合，即初步預(yù)測(cè)可獲得雜交優(yōu)勢(shì)的19個(gè)組合有：S1×S7、S1×S13和S1×S9，S4×S9和S4×S7，S5×S9和S5×S7，S6×S7和S6×S13，S8×S7、S8×S13和S8×S9，S16×S7、S16×S13和S16×S9，S18×S21和S18×S3，S20×S9和S20×S7。另外，由于雌株S2是表現(xiàn)微甜苷含量的航天突變體，故從有利于研究甜苷V代謝調(diào)控機(jī)理的角度來看，S2×S3(遺傳差異最小)是極有可能獲得甜苷含量最低果實(shí)的雜交優(yōu)勢(shì)組合。

結(jié)合上述20個(gè)雜交優(yōu)勢(shì)組合的親本預(yù)測(cè)結(jié)果和聚類圖可看出，由于雌株大多數(shù)在聚類圖的第一類，所以在第二類、第三類的雄株S3、S7、S9是較好的雄性親本材料，因此在羅漢果品種的選育上應(yīng)先考慮這3個(gè)雄株的雜交果實(shí)和子代。另外，遺傳距離較遠(yuǎn)的或單獨(dú)聚為一類的野生種質(zhì)S12、S19、S17，在開花可區(qū)分雌雄后也是非常值得關(guān)注的優(yōu)良育種材料。

3 討 論

種質(zhì)資源是育種原始創(chuàng)新的物質(zhì)基礎(chǔ)，隨著羅漢果產(chǎn)品在國內(nèi)外銷售量的快速增長，當(dāng)前主栽品種已無法完全滿足市場(chǎng)需求。為了獲得適應(yīng)市場(chǎng)的新品種，并有效提高育種效率，在已收集的羅漢果不同特異種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上，利用分子生物學(xué)手段開展遺傳差異及其雜交優(yōu)勢(shì)的親本預(yù)測(cè)是非常有必要并具有重要意義的。

ISSR分析結(jié)果中的遺傳相似性系數(shù)為 0.656～0.896，而綜合相關(guān)文獻(xiàn)[12,14-16]，羅漢果的遺傳相似性系數(shù)為0.511～1.000，表明本研究所選擇的21份羅漢果材料之間雖然有親緣關(guān)系較近的，但也存在較大的遺傳變異，其中S18、S19、S16和S17等野生種質(zhì)與桂林主產(chǎn)區(qū)的野生種質(zhì)之間以及誘變培育的航天種質(zhì)之間都產(chǎn)生了較大的遺傳差異。所以，在聚類圖中，S19、S18、S17各自聚為第二類、第四類和第五類，而S16和桂林地區(qū)的大部分野生種質(zhì)聚于第一類。在第一類和第二類中，因誘變培育相同的S2與S3以及S4與S5，因地域和品種來源相同或相近的S10與S11，S13與S14，S15與S20，S7與S19先分別兩兩聚在一起，另外S1和S16也同樣聚在一起，說明航天S1與另2個(gè)航天種質(zhì)(S2和S3)產(chǎn)生了一定的遺傳分化，而與S16的遺傳相似性更大。說明聚類結(jié)果與羅漢果種質(zhì)、人工選擇、品種、地理分布等有一定的相關(guān)性，這與彭云濤等[10]和戴俊等[14]的研究結(jié)果是一致的。另外，在分析羅漢果不同種質(zhì)的ISSR遺傳差異時(shí)，發(fā)現(xiàn)19個(gè)引物的電泳圖譜中的5個(gè)，可根據(jù)特征帶的有或無，構(gòu)建指紋圖譜并直觀地將21份材料區(qū)分開來。DNA指紋圖譜可以為羅漢果提供一種快速、準(zhǔn)確的鑒別方法，而且可將ISSR標(biāo)記中特異條帶割膠回收、克隆和測(cè)序，轉(zhuǎn)化成特異性和穩(wěn)定性更好的序列特征性擴(kuò)增區(qū)域(SCAR)標(biāo)記，該標(biāo)記對(duì)植物種間和種內(nèi)水平都有良好的鑒定效果[17]。

對(duì)于雌雄異株的植株來說，其遺傳距離及聚類圖可應(yīng)用于雜交優(yōu)勢(shì)的選擇上，并取得了良好效果，如桑樹[18]、楊樹[19]、銀杏[20]等。因此，利用ISSR的遺傳距離及聚類圖對(duì)航天早熟突變體、航天甜苷突變體、無籽優(yōu)良品系和野生品種等開展雜交優(yōu)勢(shì)親本的預(yù)測(cè)是可行的。在雜交組配時(shí)，遺傳距離最高的親本之間可能會(huì)獲得理想的雜交優(yōu)勢(shì)，但遺傳距離太高不一定是最好的組合，因?yàn)檫z傳距離過高會(huì)降低親本之間的同源性，可能導(dǎo)致雜交方向偏向遠(yuǎn)緣，使其利用價(jià)值受到影響。同樣，遺傳距離也不能過低，過低則使得親本間趨于同源，可能減弱或達(dá)不到利用雜種優(yōu)勢(shì)的效果。羅漢果雜交后代從母本繼承的遺傳物質(zhì)較多，具有母性遺傳傾向[12-13]，即在羅漢果雜交選育中母本具有的優(yōu)良性狀顯得尤為重要。所以，在對(duì)除了S2以外的8個(gè)母本進(jìn)行雜交優(yōu)勢(shì)親本預(yù)測(cè)時(shí)，重點(diǎn)關(guān)注了遺傳距離最遠(yuǎn)的前2個(gè)組合，這些親本的組合有望獲得具有優(yōu)勢(shì)的果實(shí)或子代。同時(shí)值得注意的是，航天甜苷突變體S2的微甜苷含量表現(xiàn)，S2與雄株雜交后均會(huì)獲得低甜苷的果實(shí)，S2與遺傳距離最近的S3雜交極有可能獲得比與其他雄株雜交甜苷含量更低的果實(shí)，這對(duì)甜苷V代謝調(diào)控機(jī)理的研究是有利的?？梢?，雜交優(yōu)勢(shì)親本的預(yù)測(cè)對(duì)于迫切需要選育新品種的羅漢果產(chǎn)業(yè)來說是非常有幫助的。

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