白艷鳳

組蛋白甲基化轉移酶(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)又稱為果蠅zeste基因增強子同源物2，是多梳基因家族的重要一員，與細胞的分化、增殖等關系密切，在胚胎的早期發(fā)育中普遍存在[1-2]。越來越多的研究表明EZH2的表達水平與惡性腫瘤如乳腺癌、肝癌、卵巢癌等密切相關，但與其化療耐藥的相關性報道較少[3]。本文為分析探討EZH2與卵巢癌合并肺部感染患者化療鉑類耐藥的相關性及其機制，特進行了相關研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本次實驗所用的人卵巢癌細胞系A2780及其鉑類耐藥細胞系A2780/DDP均由中南大學湘雅三醫(yī)院臨床藥理實驗室保存。主要試劑來源：PCR引物由上海英駿生物合成，Trizol試劑從美國Invitrogen公司進口，逆轉錄酶試劑盒及PCR反應液由日本Toyobo公司進口，熒光標志物從北京中杉試劑公司購買，山羊血清及β-actin抗體(BM0627)從武漢boster公司購買，BCA蛋白測定試劑盒、IP和Western細胞裂解液均從碧云天公司購買，EZH2抗體(ab3748)由美國ABCAM公司進口，LumiGLO發(fā)光物購于深圳晶美公司，酶標記物IgG(H+L)由美國Pierce公司進口。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)箱設定溫度為37 ℃、相對濕度為90%、CO2為5%，A2780采用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)貼壁生長；A2780/DDP培養(yǎng)箱設定條件同前，不同的是在兩代培養(yǎng)液中加入濃度為5 μmol/L的順鉑來維持耐藥性。

1.2.2 RT-PCR檢測EZH2mRNA及蛋白表達 提取各細胞的總RNA，并根據(jù)反轉錄說明書將其反轉為cDNA，應用ABI 7300PCR定量儀行PCR反應。EZH2內(nèi)參為GAPDH，下游引物為5-TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC-3,上游引物為5-TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC-3;設定PCR無模版陰性對照，在試驗完成后作熔解曲線進行分析以判斷產(chǎn)物是不是單一。重復本次試驗3次。

1.2.3 Western檢測EZH2 mRNA及蛋白表達 將各細胞收集后應用RIPA裂解法提取各細胞總蛋白，并應用BCA法對蛋白質(zhì)濃度進行測定。提取50 μg的總蛋白進行分離并用硝酸纖維素膜封閉，加入β-actin單克隆抗體和EZH2單克隆抗體以500∶1的比例稀釋后加入二抗，1 h后用電化學進行發(fā)光顯色。灰度分析應用Quantity One 電腦軟件進行分析，重復本次試驗3次。

1.2.4 免疫熒光法檢測EZH2 mRNA及蛋白表達 將收集的細胞數(shù)調(diào)整到24孔板內(nèi)，并置于相對濕度為90%、CO2為5%、溫度為37 ℃的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，選取適宜細胞行實驗，先應用PBS進行洗滌，應用4%的多聚甲醛進行固定，時間為15 min，并用山羊血清進行1 h封閉，封閉后加入EZH2抗體在培養(yǎng)箱中培育2 h，并在避光條件下加入熒光二抗繼續(xù)避光培育2 h，將顯微鏡倒置照相。重復本次試驗3次。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 RT-PCR檢測EZH2mRNA及蛋白表達

經(jīng)PT-PCR檢測,EZH2 mRNA和蛋白在A2780細胞中的表達水平分別為(0.68±0.19)、(0.10±0.02)，而在A2780/DDP細胞中的表達水平分別為(1.12±0.21)、(0.22±0.10)，兩者差異均有統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 RT-PCR檢測EZH2 mRNA及蛋白表達結果

2.2 Western檢測EZH2 mRNA及蛋白表達

經(jīng)Western檢測,EZH2 mRNA和蛋白在A2780細胞中的表達水平分別為(0.67±0.16)、(0.11±0.04)，而在A2780/DDP細胞中的表達水平分別為(1.20±0.212)、(0.24±0.12)，兩者差異有統(tǒng)計學意義，如表2所示。

表2 Western檢測EZH2 mRNA及蛋白表達結果

2.3 免疫熒光法檢測EZH2 mRNA及蛋白表達

經(jīng)過免疫熒光法檢測,EZH2 mRNA和蛋白在A2780細胞中的表達水平分別為(0.71±0.13)、(0.14±0.11)，而在A2780/DDP細胞中的表達水平分別為(1.31±0.34)、(0.28±0.15)，兩者差異有統(tǒng)計學意義，如表3所示。

表3 Western檢測EZH2 mRNA及蛋白表達結果

由此可見，3種試驗方法均表明EZH2蛋白在A2780及A2780/DDP中的表達主要以核表達為主，且A2780/DDP的表達明顯高于A2780，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；EZH2 mRNA的表達在A2789/DDP中較A2780增加更為顯著(P<0.05)。

3 討論

卵巢癌是目前婦女常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著患者的生活質(zhì)量和生命安全[4]。目前對于卵巢癌臨床主要以手術治療為主，并進行輔助化療，輔助化療雖可提高患者的總體反應率和生存率[5]，但同時也帶來了多種耐藥現(xiàn)象而影響治療，因此，尋找一種逆轉耐藥以提高化療藥物敏感度的基因已經(jīng)成為了腫瘤患者及專家們的關注焦點[6-7]。EZH2持續(xù)激活可引起細胞的異常惡化增殖，因此被當成是一種癌候選基因，且多種惡性腫瘤如乳腺癌、前列腺癌及肝細胞癌等均被證實其EZH2表達水平增高[8]。有研究表明[9-10]EZH2基因的表達與化療鉑類耐藥性存在一定的相關性，它可特異性的通過位點將組蛋白上賴氨酸(位于27位，H3-K27)甲基化從而沉默抑癌基因轉錄及改變?nèi)旧|(zhì)的構象，使得癌細胞增殖并抑制凋亡。

本次研究為分析探討組蛋白甲基化轉移酶與卵巢癌合并肺部感染患者化療鉑類耐藥的相關性及其機制，進一步為臨床診治卵巢癌合并肺部感染患者提供相關的理論指導與依據(jù)，對人卵巢上皮性癌細胞株A2780、鉑類耐藥細胞株A2780/DDP分別采用免疫熒光法、RT-PCR及Western blot方法檢查其EZH2 蛋白及mRNA表達的水平差異，探討EZH2對上皮性癌細胞株A2780和鉑類耐藥細胞株A2780/DDP表達水平的差異性。結果發(fā)現(xiàn)3種試驗方法均表明EZH2(組蛋白甲基化轉移酶)蛋白在A2780及A2780/DDP中的表達主要以核表達為主，且A2780/DDP的表達明顯高于A2780，兩者比較差異性顯著，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；EZH2 mRNA的表達在A2789/DDP中較A2780增加更為顯著，兩者比較，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本研究顯示了EZH2(組蛋白甲基化轉移酶)mRNA及蛋白在卵巢癌細胞A2780和耐順鉑細胞A2780/DDP中的表達水平的差異性，表明了EZH2與卵巢癌患者鉑類耐藥具有一定的相關性，但其具體作用機制是通過協(xié)同DNA阻斷細胞凋亡引起耐藥還是通過甲基化使癌細胞對順鉑產(chǎn)生耐藥作用尚無法確定，還有待進一步的分析研究[11-12]。

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