馬雪曼 王笑民 于明薇 張甘霖 楊國旺 于 潔

肺癌作為第二大最普遍的惡性腫瘤，其死亡率在世界范圍內(nèi)仍然居高不下。據(jù)統(tǒng)計，非小細(xì)胞肺癌則占據(jù)了肺癌總病例的85%，其中包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌[1]。在目前的治療方式下非小細(xì)胞肺癌的5年存活率僅為15%[2]，更安全有效的治療方式被迫切需要。在肺癌的新型治療方法的研究中1個主要的障礙是缺乏簡便易行的、可重復(fù)的、臨床相似度更高的動物模型。原位移植瘤和異位移植瘤相比，其優(yōu)點(diǎn)在于腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境與肺癌臨床情況相符合。在曾經(jīng)常用的皮下移植瘤模型中，一些抗轉(zhuǎn)移的藥物缺乏響應(yīng)，使得原位移植瘤模型更受到藥物試驗(yàn)的推崇[3]。已經(jīng)有很多種肺原位移植瘤模型的建立方法被報道，最常用的方法包括經(jīng)氣管細(xì)胞注射法和經(jīng)胸壁細(xì)胞注射法[4]。然而，由于這些肺原位移植瘤模型的建立方法缺乏簡便性和可重復(fù)性，原位移植瘤的實(shí)時監(jiān)測對實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)儀器有較高的依賴性，其成瘤性不穩(wěn)定，手術(shù)創(chuàng)傷大，荷瘤鼠生存時間短等局限性，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究依然沿用皮下移植瘤模型。本研究中，我們同時建立了生物發(fā)光的肺癌原位移植瘤模型和異位皮下移植瘤模型，對這兩種模型小鼠進(jìn)行觀察，對比它們的一般情況、成瘤情況、轉(zhuǎn)移情況，并對比兩種模型的病理學(xué)差異。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

小鼠ll2-luc-m38肺癌細(xì)胞株( ATCC細(xì)胞庫，美國)，10%胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶(均為Hyclone公司產(chǎn)品，美國)，異氟烷，河北一品制藥有限公司。一抗 VEGF(ab46154)購自Abcam Biotechnology公司。熒光素(D-Luciferin)購自美國GOLD BIOTECHNOLOGY公司，用PBS溶解稀釋為15 mg/ml的溶液，0.22 μm濾器過濾后避光保存。電子游標(biāo)卡尺：上海申韓量具有限公司；小動物活體成像系統(tǒng)(In-vivo imagingsystem，IVIS)：美國Caliper公司；CO2培養(yǎng)箱：日本三洋公司；微量移液器：eppendorff公司；離心機(jī)：北京白洋醫(yī)療器械有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈臺、電子稱等均由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級 C57BL/6純系小鼠，6～8周齡，雄性，體重19～21 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心無特定病原體(specificpathogen free，SPF)的飼養(yǎng)間，并進(jìn)行無菌接種，所有實(shí)驗(yàn)操作程序均經(jīng)過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心批準(zhǔn)，并按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將小鼠Lewis肺癌細(xì)胞置于含10%胎牛血清及高糖DMEM的完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1d更換培養(yǎng)液1次，每2 d用0.25%胰酶消化傳代一次，細(xì)胞匯合率達(dá)90%時，收集細(xì)胞，離心去上清，加入生理鹽水吹打，使細(xì)胞懸浮于生理鹽水中，臺盼藍(lán)染色細(xì)胞活力測定大于95%，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml、2×107/ml的細(xì)胞懸液備用。

1.3.2 注射前 Matrigel 的準(zhǔn)備 將-20 ℃長期保存的Matrigel置于4 ℃冰箱中過夜融化，將已融化的Matrigel和2 × 107/ml 濃度的細(xì)胞懸液按 1∶ 1混勻，所有操作在冰浴中進(jìn)行。

1.3.3 分組 小鼠共40 只，其中20只建立肺癌原位移植瘤模型，20只建立皮下移植瘤模型。每組10只用于觀察移植瘤的生長情況和轉(zhuǎn)移情況，另外10只用于生存曲線的測定。

1.3.4 原位肺癌動物模型的建立 麻醉：氧氣與異氟烷按比例混合對小鼠進(jìn)行呼吸麻醉。 接種：將小鼠麻醉后，右側(cè)臥位置于操作臺上，對小鼠腋下剪毛并用乙醇消毒，在左腋前線肋弓上約1.5 cm處作一個5 mm大小的切口，分離皮膚及皮下組織，暴露胸壁，至能看到肺葉隨呼吸上下活動為止，將 50 μl混有Matrigel的細(xì)胞懸液用微量進(jìn)樣器在室溫下放置2 min后，再注射至左肺上，進(jìn)針深度約3 mm，注射后停針數(shù)秒，拔針后縫合切口[5]。

1.3.5 肺癌皮下移植瘤動物模型的建立 小鼠注射部位用75%酒精消毒，無菌注射器吸取細(xì)胞懸液，右側(cè)腋后線下2 cm處斜行入針，刺入皮下，每只注射0.1 ml的1×107/ml細(xì)胞懸液，形成圓形小皮丘，注射完按壓入針點(diǎn)，出針。

1.4 小鼠體重及一般情況

每周兩次使用電子天平稱量小鼠體重，觀察小鼠進(jìn)食、飲水、皮毛光澤度和脫落等情況。每組隨機(jī)抽取10只小鼠觀察生存時間并記錄。

1.5 小動物活體成像系統(tǒng)檢測腫瘤生長和轉(zhuǎn)移情況

小動物活體成像儀每7天檢測1次荷瘤小鼠移植瘤及轉(zhuǎn)移灶腫瘤光子數(shù)。小鼠背部皮下注射200 μL底物熒光素10 min后應(yīng)用小動物活體成像系統(tǒng)檢測皮下移植瘤生物發(fā)光及轉(zhuǎn)移情況。具體原理為：ll2-luc-m38是能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶(luciferase，luc)的細(xì)胞株，當(dāng)外源性給予底物熒光素(luciferin)時，熒光素酶催化熒光素的氧化反應(yīng)，即可在體內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，發(fā)光強(qiáng)度可以用小動物活體成像儀器(IVIS)進(jìn)行檢測。

1.6 解剖學(xué)和病理學(xué)檢測

接種后第21天脫頸椎處死小鼠，或?qū)⒁呀?jīng)死亡的小鼠，進(jìn)行詳細(xì)的解剖并取材，檢查肺轉(zhuǎn)移及其他器官轉(zhuǎn)移情況。取出皮下移植瘤及小鼠肺臟，用10%中性甲醛固定，經(jīng)脫水透明石蠟包埋，切片，HE染色及二步法免疫組化染色(VEGF)，封片，光鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重及一般情況

每周2次用電子天平稱量小鼠體重，繪制小鼠體重變化曲線(圖1)。皮下移植瘤模型組小鼠體重逐漸上升；原位移植瘤模型組小鼠體重逐漸增加，在腫瘤接種后第14天達(dá)到最高體重，隨著肺原位移植瘤的進(jìn)一步增大，體重逐漸下降。兩組小鼠在接種兩周后均出現(xiàn)進(jìn)食進(jìn)水量減少，活動減少，皮毛失去光澤，有卷曲脫落的現(xiàn)象。

圖1 小鼠體重變化曲線

2.2 腫瘤形成和轉(zhuǎn)移情況

每7天用小動物成像儀檢測小鼠移植瘤生物發(fā)光強(qiáng)度。成瘤時間：肺原位移植瘤和皮下移植瘤的兩組小鼠均在接種當(dāng)天檢測到微弱的生物發(fā)光，隨時間延長生物發(fā)光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。皮下移植瘤和肺原位移植瘤的成瘤率均為100%。接種后第14天，肺原位移植瘤組小鼠檢測到對側(cè)胸部出現(xiàn)腫瘤生物發(fā)光，接種后第21天，皮下移植瘤組小鼠檢測到皮下移植瘤(右腋下)同側(cè)或?qū)?cè)胸部出現(xiàn)腫瘤生物發(fā)光。接種后第21天對小鼠進(jìn)行解剖觀察：肺原位移植瘤組小鼠左肺(接種部位)可見腫瘤結(jié)節(jié)形成，部分小鼠對側(cè)肺臟亦可見腫瘤結(jié)節(jié)，同時部分小鼠出現(xiàn)了胸膜轉(zhuǎn)移、心包轉(zhuǎn)移、胸骨柄轉(zhuǎn)移，其中1只小鼠出現(xiàn)了腎臟轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為100%；皮下移植瘤組小鼠右側(cè)腋下(接種部位)形成一個體積較大、類圓形的腫瘤，部分小鼠肺部出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移率為70%。

2.3 病理檢測結(jié)果

皮下移植瘤呈囊實(shí)性，隨腫瘤體積增大瘤體中央可出現(xiàn)破潰出血，壞死、脫落。肺原位腫瘤周圍看到肺泡受壓萎縮，肺周圍組織遭受浸潤，肺泡壁增厚，炎性細(xì)胞增多。肺原位移植瘤和皮下移植瘤均表現(xiàn)出腺癌的病理特征，細(xì)胞形成大小不等，形狀不一，排列不規(guī)則的癌巢，細(xì)胞分化差，核大，深染，核質(zhì)比增大，核分裂相多見[6]。免疫組化染色結(jié)果示，肺原位移植瘤VEGF表達(dá)高于異位皮下移植瘤。

2.4 小鼠生存情況

接種后持續(xù)觀察40天，皮下移植瘤組小鼠接種后第21天死亡1只，第28天死亡3只，第35天死亡2只，40天觀察結(jié)束時4只存活。肺原位移植瘤組小鼠接種后第14天死亡1只，第19天死亡2只，第21天死亡1只，第22天死亡1只，第23天死亡2只，第24天死亡1只，第28天死亡2只，觀察至此荷瘤小鼠全部死亡。兩組荷瘤小鼠生存曲線，見圖2。

圖2 小鼠生存曲線

3 討論

在肺癌的實(shí)驗(yàn)研究中，由于異位移植法操作簡單，一直作為首選方法，但“種子和土壤學(xué)說”已經(jīng)證實(shí)了腫瘤原發(fā)器官微環(huán)境會影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征[7]，因此學(xué)者們認(rèn)為異位移植瘤脫離了原發(fā)組織的微環(huán)境，其發(fā)生發(fā)展與臨床相去甚遠(yuǎn)，同時該模型對藥物反應(yīng)性差、轉(zhuǎn)移發(fā)生率較低、生存曲線數(shù)據(jù)與臨床脫節(jié)[8]。原位移植瘤模型在規(guī)避了以上不足的同時亦存在其自身的缺點(diǎn)，如操作復(fù)雜，有手術(shù)死亡風(fēng)險，生存期短，腫瘤發(fā)生發(fā)展不易被直觀地觀察到等。本研究中，我們同時建立了生物發(fā)光的肺原位移植瘤模型和異位皮下移植瘤模型，對這兩種模型小鼠進(jìn)行觀察，對比它們的一般情況、成瘤情況、轉(zhuǎn)移情況，并對比兩種模型的病理學(xué)差異。在非小細(xì)胞肺癌的實(shí)驗(yàn)研究中，為研究者選擇合適的動物模型提供多角度的、更為可靠的依據(jù)。

3.1 造模方法的對比

第一，注射部位的對比。異位皮下移植瘤模型的建立中，注射部位是動物體表皮下，可選擇部位較為廣泛，國內(nèi)外研究中常用的部位有背部皮下、上肢腋窩皮下、腹股溝皮下等。本研究中根據(jù)既往的預(yù)實(shí)驗(yàn)選用了左上肢腋窩皮下。肺原位移植瘤模型中，其注射部位必須是肺臟，文獻(xiàn)中左肺注射和右肺注射均有報道。

第二，注射方法的對比。異位皮下移植瘤模型的建立采用皮下注射的方法，即無菌注射刺入皮下，注射細(xì)胞懸液后形成圓形小皮丘。肺原位移植瘤模型的注射方法有經(jīng)氣管細(xì)胞注射法和經(jīng)胸壁細(xì)胞注射法，前者需要小動物CT的輔助，操作相對復(fù)雜，因此本研究選用了經(jīng)胸壁細(xì)胞注射法。即先將小鼠麻醉后消毒備皮，將注射部位的皮膚切開1個小口，暴露胸壁至能看到肺葉，用無菌注射器將細(xì)胞懸液注射至左肺。原位移植瘤模型的注射方法與皮下移植瘤模型對比，操作相對復(fù)雜，具有創(chuàng)傷性。

第三，注射物的對比。異位皮下移植瘤模型注射的細(xì)胞用無菌生理鹽水重懸，終濃度為1×107個/ml，體積為100 μl。肺原位移植瘤模型注射的細(xì)胞用混有 Matrigel的生理鹽水重懸，細(xì)胞懸液終濃度也是1×107個/ml，然而注射體積較小，為50 μl。由于小鼠肺臟本身體積較小，不宜注射體積較大的細(xì)胞懸液。同時肺臟有許多肺泡，并且不間斷的進(jìn)行著呼吸運(yùn)動，用Matrigel膠與腫瘤細(xì)胞相混有利于固定注射物在肺臟中的位置。并且 Matrigel膠中含有各種蛋白及生長因子，均為腫瘤的形成提供不可或缺的營養(yǎng)成分，有益于腫瘤細(xì)胞的快速生長[9]。

3.2 兩種模型的生物學(xué)對比

第一，荷瘤小鼠的一般狀況和生存情況對比。皮下移植瘤模型組小鼠在觀察的28天內(nèi)體重逐漸上升，觀察至第40天仍有40%的荷瘤小鼠存活，考慮到皮下瘤對小鼠內(nèi)臟并未產(chǎn)生較大的影響，因此體重持續(xù)上升，直至接種后期皮下腫瘤長勢迅猛，部分小鼠出現(xiàn)了肺臟轉(zhuǎn)移，因而后期才出現(xiàn)了惡病質(zhì)。原位移植瘤模型組小鼠前14天體重逐漸增加，隨后體重逐漸下降，觀察至第28天荷瘤小鼠無一存活，可能原因是腫瘤直接接種在肺部，隨后出現(xiàn)全身各部位的轉(zhuǎn)移，小鼠腫瘤負(fù)荷較重，故而體重下降，并伴有較重的惡病質(zhì)，小鼠生存期較短。

第二，成瘤情況和轉(zhuǎn)移情況對比。兩組模型小鼠成瘤率均為100%。皮下移植瘤模型部分小鼠出現(xiàn)了肺部轉(zhuǎn)移，原位移植瘤小鼠幾乎全部出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移部位包括雙肺、胸壁、腎臟。皮下組織相對獨(dú)立，瘤組織被皮膚包繞，血供不足，不易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。肺原位移植瘤轉(zhuǎn)移較多，因?yàn)榉闻K本身是1個血供豐富、氧氣充足、不斷進(jìn)行呼吸運(yùn)動的器官，腫瘤細(xì)胞很容易發(fā)生血性轉(zhuǎn)移、播種轉(zhuǎn)移。

第三，解剖和病理學(xué)對比。異位皮下移植瘤模型組的腫瘤位于皮下組織，肺原位移植瘤模型的腫瘤位于肺臟，后者肺癌細(xì)胞生長條件更符合臨床。HE染色和免疫組化染色結(jié)果亦表明，原位腫瘤組織中VEGF的表達(dá)明顯較高，符合肺部血供豐富、氧氣充足的腫瘤微環(huán)境。

綜上所述，本研究同時建立了兩種非小細(xì)胞肺癌模型，即以往常用的異位皮下移植瘤模型和臨床相符的肺原位移植瘤模型，同時利用小動物活體成像系統(tǒng)中的生物發(fā)光技術(shù)對比監(jiān)測兩種荷瘤小鼠腫瘤形成及轉(zhuǎn)移情況。利用Matrigel建立的Lewis非小細(xì)胞肺癌原位移植瘤模型，雖然操作相對復(fù)雜，但操作方法具有可重復(fù)性，成瘤性和轉(zhuǎn)移性較好，手術(shù)死亡率為零。病理檢測結(jié)果表明肺原位移植瘤能更好的模擬人肺癌病理特征，與該疾病臨床發(fā)生發(fā)展相一致，為深入研究肺癌奠定了基礎(chǔ)。為確定肺原位移植瘤模型的推展價值，我們希望繼續(xù)從腫瘤微環(huán)境的角度進(jìn)一步研究。

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