榮婷婷， 王維維， 王娟娟， 章黎華， 沈立松

（上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院檢驗科，上海 200092）

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）屬皰疹病毒科γ皰疹病毒亞科，為雙鏈DNA病毒。有文獻報道，全世界約有90%的人曾感染過EBV[1]。EBV感染在兒科臨床很常見，學齡前期及學齡期兒童多以傳染性單核細胞增多癥（infectious mononucleosis，IM）為表現。IM的特征是患者有大量的單個核細胞增生，其中主要是EBV特異性CD8+細胞毒性T細胞的增殖、活化[2]。而兒童慢性活動性EB病毒（chronic active Epstein-Barr virus，CAEBV）感染的病情與IM比較，更嚴重且容易反復，嚴重者會出現多器官衰竭而導致死亡[3]。有研究發(fā)現，T細胞、B細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞等在不同疾病轉歸的EBV感染患兒中的變化特點不同[4-5]。另據報道，IM患兒血清EBV DNA載量與疾病的嚴重程度相關[6]，DNA的血清載量分析對于診斷CAEBV感染也非常有意義[7]。

本研究旨在采用流式細胞術分析IM和CAEBV感染患兒的淋巴細胞表型，并對免疫細胞亞群進行定量檢測，分析IM和CAEBV感染患兒免疫狀態(tài)的特點，又通過檢測血清EBV DNA載量了解不同疾病狀態(tài)下病毒的活動情況，從而為IM與CAEBV感染2種疾病的鑒別診斷提供幫助。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年1—12月在上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院診治且進行過淋巴細胞亞群檢測的EBV感染患兒35例，其中IM患兒（IM組）17例（男10例，女7例，年齡1～4歲）、CAEBV患兒（CAEBV組）18例（男15例，女3例，年齡3～14歲）。以同期上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院體檢健康兒童15名（男10例，女5例，年齡5～14歲）作為健康對照組。

IM診斷標準：（1）以急性發(fā)熱、咽峽炎、淋巴結腫大、肝脾大等為主要臨床表現；（2）淋巴細胞比例增加（＞50%），異形淋巴細胞比例增加（＞10%）；（3）EBV衣殼抗原（viral-capsid antigen，VCA）免疫球蛋白M（immunoglobulin，IgM）陽性和／或外周血EBV DNA陽性；（4）除外巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）等感染。CAEBV感染的診斷標準參照OKANO等[8]建議的標準：（1）臨床表現為持續(xù)或復發(fā)性IM樣癥狀；（2）異常的EBV VCA抗體和早期抗原（early antigen，EA）抗體滴度升高和/或受累組織及外周血EBV DNA增加；（3）慢性病程無法用其他已知疾病解釋。

1.2 方法

1.2.1 各淋巴細胞及其亞群比例的檢測 采用FACSC anto型流式細胞分析儀及配套試劑（美國BD公司）測定T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+以及CD19+淋巴細胞和CD56+CD16+NK細胞的比例和計數。

1.2.2 EBV DNA的定量檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測EBV DNA載量，試劑由湖南圣湘基因股份有限公司生產，MX3000實時熒光檢測系統(tǒng)購自上海吉泰生物科技有限公司。嚴格按儀器和試劑說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。數據用中位數（四分位數）[M（P25，P75）]表示，非正態(tài)分布資料或等級資料多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗。相關性分析采用Spearman相關分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IM組與CAEBV組血清EBV抗體與EBV DNA載量比較

IM組EBV VCA IgM陽性15例，陰性2例；EBV VCA IgG陽性16例，陰性1例；EBV DNA均為陽性，載量為3.60（1.50，7.15）×103拷貝/mL。CAEBV組EBV VCA IgM抗體、EBV VCA IgG抗體均陽性14例，EBV VCA IgM抗體陰性而EBV VCA IgG抗體陽性4例；EBV DNA均為陽性，載量為1.25（0.19，2.95）×104拷貝/mL。IM組EBV DNA載量明顯低于CAEBV組（P=0.027）。

2.2 IM組、CAEBV組和健康對照組淋巴細胞比例和計數的比較

IM組淋巴細胞比例和計數最高，中位數分別為65.90%和7 610個/μL，CAEBV組淋巴細胞比例的中位數為48.40%，也高于健康對照組（29.71%），而CAEBV組的淋巴細胞計數較健康對照組升高不明顯。見表1。

2.3 IM組、CAEBV組和健康對照組B、NK、CD4+T和CD8+T細胞比例和計數的比較

IM組B、NK、CD4+T、CD8+T 4種淋巴細胞亞群呈現不同的變化，CD8+T細胞明顯增加，比例和計數的中位數分別為61.50%和517 個/μL，均顯著高于健康對照組和CAEBV組（P＜0.05）；B、NK、CD4+T 3種細胞的比例與健康對照組比較均顯著降低（P＜0.05），但3種細胞的計數均增加（P＜0.05）。CAEBV組僅NK細胞比例較健康對照組出現明顯下降（P＜0.05），其余差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。值得注意的是，CAEBV組與IM組比較，CD4+T細胞的比例升高而計數下降，而CD8+T細胞的比例和計數明顯降低，2個組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.4 EBV DNA載量與淋巴細胞亞群的相關性

IM組和CAEBV組EBV DNA載量與淋巴細胞亞群無相關性（P＞0.05）。見表3。

表1 健康對照組、IM組和CAEBV組外周血淋巴細胞比例及計數 [M（P25，P75）]

表2 健康對照組、IM組和CAEBV組外周血B、NK細胞比例及計數 [M（P25，P75）]

表3 EBV DNA載量與淋巴細胞亞群的相關性

3 討論

EBV被國際癌癥研究機構歸為I類致癌物質，是一種嗜淋巴細胞的DNA病毒，屬皰疹病毒屬，具有潛伏和轉化的特性[9]。有研究結果顯示，EBV感染可導致機體細胞免疫功能的不足和缺乏，可直接引起IM，同時可使T細胞、B細胞、NK細胞具備無限增殖和轉化為惡性疾病的能力，并與若干惡性腫瘤的發(fā)生有相關性[10-12]。機體感染EBV后，細胞免疫功能可發(fā)生紊亂，有研究報道證實，原發(fā)性EBV感染的最初靶細胞為B細胞，同時B細胞也成為病毒終生潛伏的場所[13]。B細胞介導了原發(fā)性、持續(xù)性的EBV感染，感染EBV后能無限增殖。在機體免疫狀態(tài)正常的情況下，這種增殖的B細胞會刺激T細胞的免疫反應，將感染EBV的B細胞殺滅，從而起到清除病毒的作用。而IM患兒的外周血出現的異形淋巴細胞并不是由病毒復制直接引起的，而是T細胞免疫反應的結果[14]。HOSHINO等[15]曾對急性EBV感染的患兒進行連續(xù)抽血檢驗，結果發(fā)現EBV的量與特異性的CD8+細胞毒性T細胞的量密切相關。CD4+/CD8+比值是重要的反映免疫狀態(tài)的檢測指標，其比例的降低與免疫系統(tǒng)損傷的程度相關。IM和CAEBV感染同為EBV感染，但CAEBV感染病情較重且容易反復，預后不良，嚴重者會導致死亡，且一些CAEBV感染患者有過IM或類似IM癥狀。因此，臨床上早期鑒別診斷IM與CAEBV感染很重要，可提早進行恰當的干預和治療，防止病情惡化。

EBV抗體測定是診斷IM與CAEBV感染的重要手段。本研究結果顯示，大部分EBV感染患兒均出現了EBV抗體的升高，但也有個別病例并未發(fā)現抗體水平升高，并且IM患兒和CAEBV感染患兒在抗體表達上難以發(fā)現明顯差異，抗體滴度的變化僅能作為EBV感染的輔助診斷。本研究結果顯示，IM淋巴細胞比例和計數均明顯升高，最主要原因是CD8+T細胞的比例和計數大幅上升，而CAEBV組淋巴細胞比例有升高，但CD4+T細胞及CD8+T細胞與健康對照組相比變化不顯著，B細胞和NK細胞比例和計數也未出現明顯降低，這與以往關于成人的文獻報道[16]有所不同，原因可能是本研究較早期地對CAEBV感染患兒的淋巴細胞亞群特征進行了監(jiān)測，患兒的免疫細胞功能還未出現明顯下調，另外兒童與成人對于EBV感染的免疫應答可能存在不同之處，尚需進一步研究。本研究中CAEBV組與IM組比較，B細胞計數變化無明顯差異，NK細胞降低，與以往文獻報道[17]也有所不同，但CD8+T細胞的變化與文獻報道[17]一致，進一步證明了IM患者CD8+細胞毒性T細胞的大量增殖導致了病毒的清除，而CAEBV感染患者存在這種免疫反應的缺陷，使病毒無法得到有效清除，臨床上表現為病情重且遷延不愈，甚至進一步發(fā)展為淋巴瘤或白血病，預后差的結論。本研究同時還分析了2種EBV感染疾病患兒的EBV DNA載量差異，結果顯示IM組EBV DNA載量明顯低于CAEBV組（P=0.027）。依據本研究的結果，對于臨床上早期初診EBV感染的患兒，如果CD8+T細胞的比例和計數沒有大幅上升并且EBV DNA載量又比較高，應警惕其為CAEBV感染患兒，臨床上應引起足夠重視。由于本研究選擇樣本為小樣本，研究結果還需要進一步驗證。尤其對于EBV DNA載量與患兒淋巴細胞亞群特征的相關性還需要大樣本數據進一步分析。

綜上所述，臨床上對于確診為EBV感染的患兒可以根據淋巴細胞亞群分析和EBV DNA載量測定輔助鑒別診斷IM和CAEBV感染，以便及時調整治療方案，避免患兒病情加重。

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