劉 娜,程傳濤,楊文彬,周 琦*

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)用超聲研究室,西安 710004;2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科;*通訊作者,E-mail:zhouqi15@163.com)

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤,且近10年發(fā)病率增長(zhǎng)迅速[1],甲狀腺乳頭狀癌是主要的病理類型,占所有甲狀腺惡性腫瘤的86%[2]。甲狀腺癌影響人群廣泛,從青少年到老年人,女性發(fā)病率是男性3倍,男性發(fā)病高峰要晚于女性10-20年[3]。甲狀腺癌發(fā)病主要與基因變異有關(guān),另外還有環(huán)境因素,目前被公認(rèn)的環(huán)境因素為電離輻射[4]。甲狀腺癌根治術(shù)是目前治療甲狀腺癌的主要方式,雖然絕大多數(shù)患者手術(shù)切除后有很好的總體生存率,但仍有一部分患者死于轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)。近年來研究發(fā)現(xiàn),對(duì)甲狀腺癌發(fā)生的分子機(jī)制的研究,有助于提供更加有效的治療手段[5]。lncRNA H19在人胚胎組織、骨骼肌肉組織大量表達(dá),其調(diào)節(jié)通路與許多腫瘤如胃腸道腫瘤、結(jié)腸腫瘤和膀胱腫瘤的基因凋亡有關(guān)[6]。但關(guān)于它在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展過程中所扮演的角色鮮有報(bào)道。此外,報(bào)道稱microRNA let7a在許多惡性腫瘤如結(jié)腸癌和喉癌中表達(dá)下調(diào)[7]。但尚無報(bào)道研究lnc RNA H19和miRNA let7a表達(dá)情況對(duì)于甲狀腺癌預(yù)后的影響,因此,探索二者與甲狀腺癌預(yù)后的相關(guān)性,期望為預(yù)測(cè)臨床結(jié)局及靶向治療和評(píng)價(jià)療效提供分子學(xué)依據(jù),是本研究的宗旨。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集從2009-01～2012-01在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院行甲狀腺癌根治術(shù)的131例甲狀腺癌組織和癌旁組織(距甲狀腺癌組織3-5 cm)為病例組。同期收集122例行甲狀腺部分切除術(shù)的甲狀腺良性腫瘤的正常甲狀腺組織作為對(duì)照組。所有標(biāo)本用10%福爾馬林固定并石蠟包埋,切片厚度4 μm備用。

納入標(biāo)準(zhǔn):①患者除了病理診斷為甲狀腺癌,其他器官?zèng)]有嚴(yán)重疾??；②患者尚未行甲狀腺癌術(shù)后為期3周的放射治療；③患者術(shù)前甲功正常；④患者無其他惡性腫瘤病史或放射線暴露史。

排除標(biāo)準(zhǔn):①患者有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或肺轉(zhuǎn)移(包括合并其他腫瘤或原發(fā)性肺癌)；②患者有精神疾患或情緒不穩(wěn)定無法配合；③患者有慢性疾病如心肌梗死、腦卒中、心衰和心房纖顫；④患者有放射治療病史。

1.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)

采用TRIzol法提取病例組與對(duì)照組樣本組織標(biāo)本RNA。按照TAKARA試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄第一個(gè)單鏈DNA(TAKARA,寶生物工程大連有限公司),合成出的cDNA作為模板用于擴(kuò)增H19和GAPDH(內(nèi)參基因)。PCR引物序列見表1。

表1PCR引物序列

Table1PrimersequencesofPCR

基因 引物序列 GAPDH上游：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′下游：5′-GGCTGTTGTCTTACTTCTCATGG-3′ H19上游：5′-GAACACCTTAGGCTGGTGGG-3′下游：5′-ATGTTGTGGGTTCTGGGAGC-3′ let7a上游：5′-GCGCCTGAGGTAGTAGGTTG-3′下游：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′

PCR反應(yīng)體系(20 μl)組成包括7.8 μl的雙蒸餾水,1.0 μl DNA模板,各0.4 μl上游和下游引物,0.4 μl ROX參考染料(50x),10.0 μlSYBR.反應(yīng)流程:95 ℃條件下,預(yù)變性2 min,接著40個(gè)循環(huán),95 ℃,5 s;冷卻到60 ℃,34 s,延伸到68 ℃,30 s;取各個(gè)樣本的cDNA及其相對(duì)應(yīng)的引物按照以上方法混合,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,收集熒光信號(hào),進(jìn)行熔解曲線分析,反應(yīng)結(jié)束后由系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算相對(duì)定量的結(jié)果,每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.3 隨訪

對(duì)患者的隨訪主要通過門診復(fù)查、電話及郵件的方式,一般在術(shù)后1月進(jìn)行一次,第一年每3個(gè)月隨訪一次,第二年每6個(gè)月隨訪一次,以后每一年隨訪一次,一直隨訪至2017年1月31號(hào)結(jié)束。隨訪率達(dá)到100%,所有患者相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)都被隨訪記錄了5年。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。lncRNA H19和miRNA let7a表達(dá)情況的比較采用卡方檢驗(yàn)和Fisher’s精確概率檢驗(yàn)。ROC曲線評(píng)價(jià)lncRNA H19和miRNA let7a對(duì)甲狀腺癌的診斷價(jià)值。Kaplan-Meier法分析甲狀腺癌5年生存率,單因素和多因素分析影響甲狀腺癌預(yù)后因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床病理特征

病例組包括男性43例,女性88例,年齡15-78歲,平均年齡(45.3±8.2)歲。對(duì)照組包括男性38例,女性84例,年齡20-74歲,平均年齡(47.1±8.7)歲。年齡和性別兩組對(duì)比差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組中,87例腫瘤直徑≥1.0 cm,44例腫瘤直徑<1.0 cm。甲狀腺癌術(shù)后病理分型中,78例為甲狀腺乳頭狀癌,29例濾泡癌,24例髓樣癌。52例腫瘤突破包膜,79例腫瘤未突破包膜。根據(jù)2002年UICC(Union for International Cancer Control)指南里甲狀腺癌TNM分期[8],51例TNMⅠ+Ⅱ期,80例TNM Ⅲ+Ⅳ期,69例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,62例沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

2.2 miRNA let7a和lncRNA H19在甲狀腺癌組織、癌旁組織及正常甲狀腺組織中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示,miRNA let7a在甲狀腺癌組織、癌旁組織及正常組織表達(dá)分別為0.54±0.31,1.03±0.43和1.13±0.38,miRNA let7a在甲狀腺癌組織中表達(dá)降低(P<0.05)。lncRNA H19在甲狀腺癌組織、癌旁組織及正常甲狀腺組織中表達(dá)分別為4.02±0.85,3.24±0.73和3.07±0.81,lncRNA H19在甲狀腺癌組織中表達(dá)升高(P<0.05)。lncRNA H19和miRNA let7a在癌旁組織和正常甲狀腺組織中表達(dá)無明顯差異(P>0.05,見圖1)。

與癌旁組織和正常甲狀腺組織比較，*P<0.05圖1 lncRNA H19和miRNA let7a在甲狀腺癌(TC)組織中的表達(dá)Figure 1 The expression of lncRNA H19 and miRNA let7a in TC

2.3 ROC曲線評(píng)價(jià)miRNA let7a和lncRNA H19對(duì)甲狀腺癌的診斷價(jià)值

miRNA let7a ROC曲線下面積0.116 (95% CI 0.076-0.157),診斷閾值0.87,敏感度和特異度分別為84.0%和77.0%,約登指數(shù)0.61。lncRNA H19 ROC曲線下面積0.801(95% CI 0.747-0.855),診斷閾值3.58,敏感度和特異度分別為72.5%和75.4%。約登指數(shù)0.479。提示當(dāng)miRNA let7a表達(dá)低于0.87或者lnc RNA H19表達(dá)超過3.58時(shí),甲狀腺癌發(fā)生機(jī)會(huì)增加(見圖2)。

2.4 miRNA let7a和lncRNA H19表達(dá)水平與甲狀腺癌臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)約登指數(shù),選取靈敏度和特異度之和的最高點(diǎn)為截?cái)嘀?miRNA let7a診斷界點(diǎn)為0.87,≥0.87表示let7a高表達(dá),<0.87表示let7a低表達(dá)。lncRNA H19診斷界點(diǎn)為3.58,≥3.58表示H19高表達(dá),<3.58表示H19低表達(dá)。miRNA let7a和lncRNA H19表達(dá)情況在性別、年齡、組織病理分型和有無包膜浸潤(rùn)組間比較差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miRNA let7a和lncRNA H19表達(dá)在腫瘤直徑≥1 cm和<1 cm組間比較,TNMⅠ+Ⅱ期和TNM Ⅲ+Ⅳ期組間比較,有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間比較,差異分別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。在腫瘤直徑≥1 cm,TNM Ⅲ+Ⅳ期,及伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中,miRNA let7a低表達(dá),相應(yīng)的lncRNA H19高表達(dá)(P<0.05,見表2)。

2.5 miRNA let7a和lncRNA H19表達(dá)與甲狀腺癌預(yù)后的相關(guān)性

術(shù)后隨訪5年的131例患者中,53例患者存活,78例患者死亡,死亡率59.5%。131例患者術(shù)后病理證實(shí),21.3%(28/131)周圍組織侵犯,10.7%(14/131)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,6.1%(8/131)對(duì)側(cè)甲狀腺轉(zhuǎn)移,52.6%(69/131)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病例中,8例肺轉(zhuǎn)移,1例肝轉(zhuǎn)移,4例骨轉(zhuǎn)移,1例腎上腺轉(zhuǎn)移。其中乳頭狀癌死亡41例,髓樣癌死亡18例,濾泡狀癌死亡19例。其中64例死于該腫瘤,14例死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Kaplan-Meier生存分析曲線顯示,miRNA let7a低表達(dá)者5年生存率35.2%(37/105),高表達(dá)者5年生存率61.5%(16/26),低表達(dá)者預(yù)后差,二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);lncRNA H19高表達(dá)者5年生存率28.44%(27/95),低表達(dá)者5年生存率72.2%(26/36),高表達(dá)者預(yù)后差,二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

圖2 lncRNA H19和miRNA let7a表達(dá)對(duì)TC診斷的ROC曲線Figure 2 ROC curve analysis of lncRNA H19 and miRNA let7a expression for TC

表2lncRNAH19和miRNAlet7a表達(dá)水平與甲狀腺癌不同臨床病理特征的相關(guān)性

Table2AssociationoflncRNAH19andmiRNAlet7aexpressionwithdifferentclinicopathologicalfeaturesofTC

臨床病理特征總數(shù)lncRNAH19高表達(dá)(n=95)低表達(dá)(n=36)χ2PmiRNAlet7a高表達(dá)(n=40)低表達(dá)(n=91)χ2P性別2531011201240725 男4335(8140)8(1860)14(3256)29(6744) 女8860(6818)28(3182)26(2955)62(7045)年齡0137071100120912 <45歲5843(7414)15(2586)18(3103)40(6897) ≥45歲7352(7123)21(2877)22(3014)51(6986)腫瘤直徑8915000480530005 <10cm4425(5682)19(4318)21(4773)23(5227) ≥10cm8770(8046)17(1954)19(2184)68(7816)組織病理分型3644016204350805 乳頭狀癌7860(7692)18(2308)25(3205)53(6795) 濾泡狀癌2917(5862)12(4138) 9(3103)20(6897) 髓樣癌2418(7500)6(2500)6(500)18(7500)包膜浸潤(rùn)2202013812970255 有5234(6538)18(3462)14(2692)38(7308) 無7961(7722)18(2278)26(3291)53(6709)TNM分期5771001625300<0001 Ⅰ+Ⅱ5131(6078)20(3922)29(5686)22(4314) Ⅲ+Ⅳ8064(8000)16(2000)11(1375)69(8625)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5461001916130<0001 有6956(8116)13(1884)10(1449)59(8551) 無6239(6290)23(3710)30(4839)32(5161)

圖3 Kaplan-Meier曲線分析lncRNA H19和miRNA let7a表達(dá)與TC生存率的關(guān)系Figure 3 Kaplan-Meier curve analysis of the relationship between lncRNA H19, miRNA let7a expression and TC survival rate

2.6 單因素分析影響甲狀腺癌預(yù)后因素

預(yù)后相關(guān)單因素分析采用Log-rank檢驗(yàn),結(jié)果顯示腫瘤直徑≥1.0 cm,高的TNM分期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí),平均生存率降低(P<0.05)?？傮w生存率(overall survival rate,OS)與性別、年齡、組織病理分型、有無包膜浸潤(rùn)等臨床病理特征無明顯相關(guān)性(P>0.05,見表3)。

表3單因素分析影響甲狀腺癌預(yù)后因素

Table3UnivariateanalysisofprognosticfactorsforTCpatients

影響因素n總體生存期(月)χ2P 性別02610609 男435019±232 女885060±172 年齡05040478 <45歲585302±178 ≥45歲734840±201 腫瘤直徑353250001 <10cm446000±000 ≥10cm874339±192 組織病理分型40280133 乳頭狀癌785237±169 濾泡狀癌294993±308 髓樣癌244514±350 包膜浸潤(rùn)00860769 有525056±178 無795038±222 TNM分期55670018 Ⅰ+Ⅱ515430±189 Ⅲ+Ⅳ804624±192 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移333860001 有694201±217 無625791±093

2.7 多因素分析影響甲狀腺癌預(yù)后因素

COX回歸模型結(jié)果提示,miRNA let7a和lnc RNA H19表達(dá),腫瘤直徑,TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響甲狀腺癌預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(P<0.05)。年齡、性別、組織病理分型、有無包膜浸潤(rùn)與甲狀腺癌預(yù)后無明顯相關(guān)性(P>0.05,見表4)。

3 討論

首先,從分子水平研究控制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)腫瘤發(fā)生和治療至關(guān)重要。H19基因位于人染色體11p15,可轉(zhuǎn)錄成大小約2.3 kb的長(zhǎng)鏈非編碼RNA,即lncRNA H19參與基因表達(dá)的調(diào)控過程[9],轉(zhuǎn)錄的H19保守印記基因簇也轉(zhuǎn)錄編碼胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF2),H19-IGF2基因?qū)ε咛グl(fā)育和生長(zhǎng)控制有重要的作用,H19抑制胚胎胎盤生長(zhǎng),在胚胎發(fā)育過程中調(diào)節(jié)印記基因。然而它在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的角色,是致癌基因還是抑癌基因,依賴于腫瘤分型和細(xì)胞內(nèi)成分[10]。有證據(jù)顯示lncRNA H19在不同惡性腫瘤多種病理狀態(tài)下呈現(xiàn)高表達(dá)[11],其表達(dá)上調(diào)提示了它可能的致癌屬性[12]。比如Wang等[13]發(fā)現(xiàn)了lncRNA H19在膽囊癌組織中高表達(dá),并揭示了lncRNA H19表達(dá)與腫瘤尺寸及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),Liu等[14]證實(shí)體外實(shí)驗(yàn)中H19能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖,lncRNA H19在膀胱癌組織中表達(dá)高于其旁非腫瘤組織。還有研究證實(shí)了lncRNA H19在胃癌組織有高表達(dá)率,且與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移都是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[15]。盡管lncRNA H19已被證實(shí)參與多種腫瘤發(fā)生[16],但它在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示lncRNA H19在甲狀腺癌組織中表達(dá)較高,且高表達(dá)者5年生存率降低,提示lncRNA H19在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中有重要作用,表達(dá)水平影響甲狀腺癌預(yù)后,有可能作為抗腫瘤治療的潛在新靶點(diǎn)。

表4多因素分析影響甲狀腺癌預(yù)后因素

Table4MultivariateanalysisofprognosticforTCpatients

影響因素BSEWaldSig．Exp(B)95%CI 年齡-006402850050082209380537-1639 性別-007603070061080409270508-1691 腫瘤直徑18590431185710001?6414 2755-14937 組織病理分型-017201730988032008420601-1181 包膜浸潤(rùn)-012302850188066508840506-1544 TNM分期-0795036747050030?04510220-0926 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1455038414360001?42842019-9092 lncRNAH19表達(dá)-0818029477620005?04410248-0785 miRNAlet7a表達(dá)-0796039340960043?04510209-0975

*P<0.05

其次,本研究對(duì)組織中miRNA let7a和lncRNA H19水平進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在甲狀腺癌組織中升高,而miRNA let7a反而降低,說明兩者之間具有一定關(guān)聯(lián)性,lncRNA H19可能對(duì)miRNA let7a具有調(diào)控作用[17]。已經(jīng)確定lncRNA不僅能夠行使miRNA的功能,對(duì)下游基因進(jìn)行調(diào)控,還能夠?qū)iRNA產(chǎn)生調(diào)控作用[18]。本研究通過進(jìn)一步與甲狀腺癌臨床病理特征相關(guān)性及預(yù)后相關(guān)因素進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)二者均與臨床分期相關(guān)聯(lián),lncRNA H19隨腫瘤的進(jìn)展程度表達(dá)隨之升高,而miRNA let7a則隨之下降。且lncH19表達(dá)上調(diào)者或者let7a表達(dá)下調(diào)者,5年生存率減低,說明二者對(duì)腫瘤的進(jìn)展存在一定作用。miRNA let7a被認(rèn)為與抑癌基因有關(guān),有很多目的基因,比如RAS和HMGA2,它還能通過靶向分子Aurora-B抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)[19]。目前,研究發(fā)現(xiàn)lncRNA H19可以抑制let7a內(nèi)源性功能,導(dǎo)致高遷移率組AT-hook2的消沉,AT-hook2在胰腺導(dǎo)管腺癌中能夠介導(dǎo)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換過程(epithelial mesenchymal transition,EMT),導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[20]。本研究結(jié)果也顯示出lncRNA H19的高表達(dá)降低了let7a的抑癌作用,二者呈負(fù)向調(diào)控,盡管二者具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚,我們可以得出結(jié)論,miRNA let7a和lncRNA H19能夠進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)作為良好標(biāo)志物的候選,對(duì)甲狀腺癌早期診斷及預(yù)后判斷有提示功能[21]。而對(duì)其基因調(diào)控機(jī)制的研究有助于分子治療。

綜上所述,結(jié)果表明miRNA let7a和lncRNA H19可能在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,是影響甲狀腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但由于受樣本量限制,其與甲狀腺癌患者的臨床病理特征的相關(guān)性尚不明確,因此,對(duì)未來進(jìn)一步研究的期望,尚需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究論證,細(xì)化腫瘤分期,繼續(xù)深入討論關(guān)于甲狀腺癌不同臨床病理特征的相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)。并對(duì)miRNA let7a和lncRNA H19調(diào)控機(jī)制及二者表達(dá)情況做更進(jìn)一步遠(yuǎn)期生存率的觀察,期望發(fā)現(xiàn)一種新的甲狀腺癌早期診斷和預(yù)后判斷的方法。

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