我國(guó)原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)男性及女性病死率在所有惡性腫瘤中分別排第4和第5位[1-2]。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是HCC的重要病因之一[3]，與血清HBV DNA陰性肝炎患者相比，當(dāng)HBV DNA>20 000 U/mL時(shí)，患者發(fā)生肝硬化和HCC的風(fēng)險(xiǎn)分別增加10倍和9倍[4]；同時(shí)肝癌患者HBV復(fù)制水平與患者預(yù)后密切相關(guān)，高HBV DNA水平HCC患者預(yù)后更差、更易復(fù)發(fā)[5]?？共《局委熆梢越档筒《緮y帶者HCC發(fā)生率[6]，并顯著改善HCC患者預(yù)后[7]。因此，監(jiān)測(cè)HCC患者HBV復(fù)制水平對(duì)于指導(dǎo)肝癌患者的抗病毒治療具有重要的臨床意義[8]。

肝細(xì)胞內(nèi)HBV病毒基因組包括松弛環(huán)狀DNA(relax circular DNA，rcDNA)和共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circularDNA, cccDNA)，其中cccDNA是HBV復(fù)制的原始模板，肝細(xì)胞cccDNA定量是評(píng)價(jià)抗病毒藥物療效的金指標(biāo)[9]。近年來(lái)，臨床研究[10]和體外研究[11]均表明慢乙肝患者HBeAg與cccDNA具有良好的相關(guān)性。因此，本研究主要探討HCC患者血清HBeAg與肝細(xì)胞HBV DNA及cccDNA的關(guān)系，并使用血清學(xué)指標(biāo)構(gòu)建預(yù)測(cè)組織HBV DNA及cccDNA的多元回歸模型，為更好地評(píng)價(jià)HCC患者肝細(xì)胞HBV DNA及cccDNA水平提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 收集2012～2015年在解放軍第105醫(yī)院接受肝癌切除術(shù)的HCC患者96例，HCC患者癌組織及癌旁組織均術(shù)中收集并保存于-80℃冰箱備用，癌旁組織為距離癌組織切緣2～3 cm切下的約0.5 cm3的樣本。本研究經(jīng)解放軍第105醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有HCC患者均經(jīng)組織病理確診，同時(shí)滿足HBsAg陽(yáng)性，血清HBV DNA>1 000 U/mL，無(wú)抗病毒用藥史。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并或其他肝炎病毒(如丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒等)感染、肝移植、血液病或其他實(shí)體腫瘤。

1.2 血清標(biāo)志物檢測(cè) 使用雅培i2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(Abbott，美國(guó))及其配套試劑[Abbott,美國(guó)；試劑批號(hào)：乙肝表面抗原(43417LF00)，乙肝表面抗體(37323LF00)，HBeAg(34833LI00)，HBeAb(33798LI00)，乙肝核心抗體(33674LI00)]檢測(cè)HBV感染標(biāo)志物。

1.3 血清HBV DNA及肝細(xì)胞HBV DNA、cccDNA檢測(cè) 使用QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN，德國(guó))提取血清及組織HBV DNA，使用ABI 7500熒光定量PCR儀(Life Technologies Corporation，美國(guó))檢測(cè)血清HBV DNA及組織cccDNA。定量檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[12]，使用質(zhì)粒安全ATP依賴的NDA酶處理肝細(xì)胞總DNA，獲得HBV DNA及cccDNA，使用Taqman熒光探針PCR法檢測(cè)HBV DNA及HBV cccDNA，使用引物F1和R1，TaqMan探針P1，對(duì)組織HBV cccDNA進(jìn)行定量，使用引物F2和R2，TaqMan探針P2對(duì)組織HBV DNA進(jìn)行定量。組織內(nèi)HBV DNA和cccDNA定量均參考組織甘油醛3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GADPH)定量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[13]，各引物序列詳見表1。

表1 肝細(xì)胞HBV DNA及cccDNA定量檢測(cè)引物列表

1.4 分組及觀察指標(biāo) 根據(jù)HBV感染階段將HCC患者分成3組：HBeAg(﹢)/HBeAb(-)組、HBeAg(﹢)/HBeAb(﹢)組及HBeAg(-)/HBeAb(﹢)組，比較3組血清、肝癌組織及癌旁組織HBV DNA及cccDNA水平的差異。

2 結(jié)果

2.1 不同HBV感染階段HCC患者組織HBV DNA及cccDNA水平比較 不同HBV感染階段HCC患者年齡、性別存在差異，但各組腫瘤病理學(xué)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。HBeAg(+)/HBeAb(-)組血清HBV DNA、癌旁組織HBV DNA及cccDNA水平高于HBeAg(-)/HBeAb(+)組(P<0.05)，HBeAg(+)/HBeAb(-)組癌旁組織cccDNA高于HBeAg(+)/HBeAb(+)組(P<0.05)，HBeAg(+)/HBeAb(+)組癌組織中HBV DNA高于HBeAg(-)/HBeAb(+)組(P<0.05)。詳見表3。

表2 不同HBV感染階段HCC患者基本信息

指標(biāo)HBeAg(+)/HBeAb(-)組(n=20)HBeAg(+)/HBeAb(+)組(n=18)HBeAg(-)/HBeAb(+)組(n=58)F值P值癌組織cccDNA(log10U/106cells)3.4±1.64.5±1.63.5±1.4#3.8190.026癌組織HBVDNA(log10U/106cells)5.7±0.86.0±1.25.5±1.42.8490.063癌旁組織cccDNA(log10U/106cells)5.4±1.34.1±1.2*4.2±0.9*5.7830.004癌旁組織HBVDNA(log10U/106cells)7.0±1.56.3±1.25.7±1.0*6.2310.002血清HBVDNA(log10U/mL)5.5±1.15.0±1.04.5±1.0*13.389<0.001

2.2 肝癌患者血清HBeAg與組織HBV DNA及cccDNA的關(guān)系 HCC患者血清HBeAg與癌旁組織 HBV DNA(r=0.476，P<0.001，圖1A)及cccDNA(r=0.549，P<0.001，圖1C)存在相關(guān)性，與癌組織HBV DNA(r=0.064，P=0.540)、癌組織cccDNA(r=0.132，P=0.219)無(wú)相關(guān)性。同時(shí)血清HBV DNA與癌旁組織 HBV DNA(r=0.440，P<0.001，圖1B)及cccDNA(r=0.359，P<0.001，圖1D)存在相關(guān)性，但與癌組織中HBV DNA(r=0.047，P=0.652)及cccDNA(r=0.129，P=0.230)無(wú)相關(guān)性。詳見圖1。

圖1 HCC患者血清HBeAg、HBV DNA與肝細(xì)胞組織HBV DNA和cccDNA的相關(guān)性

2.3 不同TNM分期肝癌HBeAg與組織HBV DNA及cccDNA關(guān)系 肝癌患者血清HBeAg與癌旁組織中cccDNA 和HBV DNA均存在相關(guān)性(P<0.05)，與癌組織cccDNA及HBV DNA水平無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，而血清HBV DNA僅在TNM I期及III期患者與癌旁組織cccDNA及HBV DNA存在相關(guān)性(P<0.05)。詳見表4。

2.4 癌旁組織HBV DNA及cccDNA的預(yù)測(cè)模型構(gòu)建 使用血清學(xué)指標(biāo)利用多元回歸模型預(yù)測(cè)癌旁組織HBV DNA及cccDNA，使用HBeAg、血清HBV DNA及乙肝核心抗體(hepatitis B core antibody，HBcAb)可以預(yù)測(cè)癌旁組織HBV DNA(R2=0.549)及cccDNA(R2=0.542)，回歸方程為：癌旁組織HBV DNA= 5.422+ 0.551×血清HBV DNA+0.308×HBeAg+0.239×HBcAb，癌旁組織cccDNA=0.525+0.439×血清HBV DNA+0.436×HBeAg+0.168×HBcAb。詳見表5。

3 討論

HBV cccDNA 是HBV前基因組RNA(pregenome mRNA, pgmRNA)復(fù)制的原始模板，是HBV循環(huán)復(fù)制以及持續(xù)感染的關(guān)鍵因素[14]?，F(xiàn)有核苷(酸)類似物無(wú)法直接作用于cccDNA，肝細(xì)胞cccDNA的存在是HBV病毒難以清除的關(guān)鍵因素[15]，故肝細(xì)胞cccDNA水平對(duì)于HCC患者抗病毒治療的監(jiān)測(cè)具有重要意義。但由于肝活檢監(jiān)測(cè)肝組織中cccDNA水平還存在一定的困難，故探討能反映其水平的非侵入性替代檢測(cè)指標(biāo)具有重要意義。

表4 不同分期HCC患者血清HBeAg、HBV DNA與肝HBV DNA相關(guān)性分析

表5 癌旁組織HBV DNA和cccDNA的多元回歸分析

本研究中，不同感染階段HCC患者血清HBV DNA、癌旁組織HBV DNA及cccDNA水平存在差異，HBeAg(+)/HBeAb(-)組高于HBeAg(-)/HBeAb(+)組，且隨著患者免疫狀態(tài)由HBeAg陽(yáng)性向陰性轉(zhuǎn)換而降低；HBeAg(+)/HBeAb(-)組HCC患者癌旁組織中cccDNA水平高于HBeAg(+)/HBeAb(+)組，而HBeAg(+)/HBeAb(+)組與HBeAg(-)/HBeAb(+)組癌旁組織cccDNA水平無(wú)顯著改變，這與相關(guān)研究[10-11，16]結(jié)果一致，表明進(jìn)入血清轉(zhuǎn)換狀態(tài)后，患者cccDNA水平趨于穩(wěn)定。HBeAg(+)/HBeAb(+)組患者癌組織中HBV DNA和cccDNA高于HBeAg(-)/HBeAb(+)組，表明在不同感染階段，癌組織與癌旁組織HBV DNA的變化還受病毒所處組織微環(huán)境的影響。

HBV復(fù)制周期中，以cccDNA為模板合成pgmRNA，其前C/C區(qū)既是HBcAg的模板，也是HBeAg合成的模板[17]，故cccDNA水平直接決定了HBcAg及HBeAg的水平。本研究表明，HCC患者中HBeAg與癌旁組織HBV DNA和cccDNA有相關(guān)性，HBeAg與癌組織中HBV DNA和cccDNA水平無(wú)相關(guān)性，可能原因包括：①血清HBeAg主要源于癌旁組織，癌旁組織反映的是整個(gè)肝臟的狀況，而癌組織僅占肝臟的較小部分；②這可能與乙肝相關(guān)肝癌時(shí)期病毒復(fù)制周期改變有關(guān)，在慢乙肝患者或癌旁組織中，乙肝病毒基因復(fù)制、成熟及分泌整個(gè)過程有條不紊，HBV DNA復(fù)制水平與前C/C基因表達(dá)水平較為一致，而在癌組織，這種一致性很可能被打破[17]，從而表現(xiàn)為HBeAg與癌旁組織中指標(biāo)呈相關(guān)性，而與癌組織中指標(biāo)無(wú)相關(guān)性。近年來(lái)，乙肝c相關(guān)抗原(hepatitis B core-related antigen，HBcrAg )被證明與乙肝患者肝內(nèi)cccDNA具有較好的相關(guān)性[18-19]，但其臨床應(yīng)用仍然有限，相比而言，HBeAg檢測(cè)應(yīng)用更為廣泛，更便于臨床應(yīng)用。

此外，本研究進(jìn)一步分析了不同TNM分期HCC患者HBeAg與組織HBV DNA及cccDNA的相關(guān)性，結(jié)果表明，HBeAg均與癌旁組織HBV DNA和cccDNA顯著相關(guān)，盡管TNM I期與III期患者血清HBV DNA與組織HBV DNA和cccDNA相關(guān)系數(shù)更高，但I(xiàn)I期患者血清HBV DNA與癌旁組織HBV DNA和cccDNA無(wú)相關(guān)性，表明血清HBeAg水平對(duì)于組織HBV DNA和cccDNA水平的監(jiān)測(cè)具有較好的穩(wěn)定性。

最后，我們使用了HBV感染的血清學(xué)指標(biāo)構(gòu)建了癌旁組織HBV DNA及cccDNA的預(yù)測(cè)模型，可以預(yù)測(cè)癌旁組織HBV DNA及cccDNA的變化，R2分別為0.549及0.542，表明上述指標(biāo)與組織HBV DNA均具有一定的相關(guān)性，本研究中血清HBV DNA與HBeAg均與癌旁組織HBV DNA及cccDNA有相關(guān)性，而HBcAb與癌旁組織HBV DNA及cccDNA無(wú)相關(guān)性。但既往研究[20]表明，HBcAb可單獨(dú)預(yù)測(cè)HBeAg血清轉(zhuǎn)換，與cccDNA具有相似的意義，故進(jìn)入了組織HBV DNA的預(yù)測(cè)模型，同時(shí)使用多變量回歸模型預(yù)測(cè)癌旁組織HBV DNA及cccDNA優(yōu)于使用單個(gè)指標(biāo)(單獨(dú)使用血清HBV DNA及HBeAg預(yù)測(cè)時(shí)，R2均<0.4)，未來(lái)納入更多變量時(shí)，其預(yù)測(cè)效果可進(jìn)一步提高。

綜上所述，不同HBV感染階段HCC患者其癌旁組織HBV DNA和cccDNA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血清HBeAg及HBV DNA與癌旁組織HBV DNA和cccDNA具有較好的相關(guān)性，且血清HBeAg與癌旁組織HBV DNA和cccDNA顯著相關(guān)，不受TNM分期影響，使用血清學(xué)指標(biāo)構(gòu)建的組織HBV DNA和cccDNA回歸模型，可用于預(yù)測(cè)組織HBV DNA和cccDNA變化，更易于臨床檢測(cè)，故可以更好地監(jiān)測(cè)HCC患者HBV感染狀況，為HCC患者抗病毒治療提供更多指導(dǎo)。

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