槲皮素是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒以及清除自由基等多種作用[1]。研究[2-5]表明，槲皮素可有效抑制乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌及卵巢癌等多種惡性腫瘤細胞的增殖。同時，槲皮素還可增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，可與其他化療藥物聯(lián)合用于腫瘤的化學(xué)治療[6-10]。

因此，本研究通過槲皮素作用于人宮頸癌C33A細胞,研究槲皮素對C33A細胞增殖及凋亡的影響，并初步探討其相關(guān)作用機制，為臨床槲皮素治療宮頸癌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人子宮頸癌細胞系C33A購自武漢普諾賽生命科技有限公司(CL-0045)。 槲皮素購于Sigma公司(Q4951)，順鉑購于Sigma公司(479306-1G)， DMEM培養(yǎng)基購于Gibco公司(12100-046)，胎牛血清購于HyClone公司(SH30070.04)，Cyclin D1鼠單克隆抗體(sc-20044)、Caspase-3鼠單克隆抗體(sc-273503)、Caspase-9鼠單克隆抗體(sc-273525)和β-actin鼠單克隆抗體(sc-130656)均購于Santa Cruz公司，二甲基亞砜 (dimethylsulfoxide， DMSO)購于Sigma公司(D-2678)，噻唑藍染液(thiazole blue，MTT)購于Sigma公司(BR-03955)，其余為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人宮頸癌C33A細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于含5%CO2的37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng), 每3～4 d用胰酶消化、傳代1次。

1.2.2 藥物配置與實驗分組 將241.792 mg槲皮素溶于10 mL DMSO中作為備用母液，-20℃保存?zhèn)溆?。實驗時，將1 mL母液加入999 mL DMEM培養(yǎng)液稀釋為80 μmol/L，之后分別等倍稀釋為20、40 μmol/L，DMSO的最終濃度<0.1%。將C33A細胞分為對照組(1640培養(yǎng)基+DMSO)、槲皮素組(20、40和80 μmol/L)、順鉑組(5、10、15、20 μg/mL)、聯(lián)合組(槲皮素40 μmol/L+順鉑 10 μg/mL[11])。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力 C33A細胞經(jīng)胰酶消化后，制成單細胞懸液，按照4×104個/孔的細胞濃度接種于96孔板中，每孔加入200 μL 1640培養(yǎng)液。待細胞貼壁后,換為含有不同濃度的槲皮素和順鉑培養(yǎng)液培養(yǎng)。各孔細胞在培養(yǎng)24 h和48 h后，吸棄培養(yǎng)液，分別加入100 μL MTT(5 g/L)，37℃孵育4 h后吸棄上清液；再分別加入150 μL DMSO，混勻后測定490 nm波長處每孔的光密度值(optical density，OD) ，每組均設(shè)置3個復(fù)孔。細胞活力計算公式：細胞活力(%)=(槲皮素組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 C33A細胞經(jīng)胰酶消化后，接種于6孔板中，待細胞貼壁后, 更換為含有不同濃度(空白對照、20、40和80 μmol/L)槲皮素的培養(yǎng)液中。48 h后收集各組細胞，1 000 r/min離心5 min后，吸棄上清，加入70%酒精4 ℃固定12 h。再次離心，用含0.01% RNase的碘化丙啶(propidium iodide，PI)避光染色30 min后，上機檢測。通過CellQuest軟件分析結(jié)果，每組均設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.5 Western Blot檢測蛋白表達 C33A細胞經(jīng)胰酶消化后，接種于6孔板中，待細胞貼壁后, 更換為含有不同濃度(空白對照、20、40和80 μmol/L)槲皮素的培養(yǎng)液中。48 h后收集細胞，裂解并測定各組細胞的蛋白濃度，行SDS-PAGE分離蛋白。電泳結(jié)束后，將膜移至含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中室溫封閉1 h，TBST洗膜10 min×4次。加入一抗，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，用檢測液行發(fā)光反應(yīng)，于暗室中曝光，通過Image J軟件進行灰度分析，計算蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對C33A細胞活力的影響 經(jīng)過槲皮素處理24 h后，各組細胞活力分別為(86.92±3.953)%(20μmol/L組)、(66.54±3.932)%(40μmol/L組)和 (52.21±2.970)%(80μmol/L組)，均低于空白對照組的(98.35±1.230)% ；經(jīng)過槲皮素處理48 h后，各組細胞活力分別為(65.19±7.071)%(20μmol/L組)、(47.04±8.881)%(40μmol/L組)和 (29.71±6.505)%(80μmol/L組)，均低于空白對照組的(96.97±1.788)%。C33A細胞經(jīng)過不同濃度的槲皮素處理后，細胞活力均低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)不同濃度的順鉑(5、10、15、20 μg/mL)處理后C33A細胞的細胞活力也低于空白對照組(P<0.05)；此外，槲皮素40 μmol/L+順鉑 10 μg/mL聯(lián)合作用于C33A細胞24 h后，細胞活力下降為(31.12±2.835)%； 48 h后，細胞活力下降為(17.86±3.182)%，低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 槲皮素及順鉑對C33A細胞活力的影響

2.2 槲皮素對C33A細胞周期的影響 C33A細胞分別經(jīng)不同濃度(空白對照、20、40和80 μmol/L)槲皮素作用48 h后，G0/G1期細胞百分比為(47.07±2.404)%、(52.48±1.188)%、(60.30±1.874)%和(64.54±2.157)%，S期細胞百分比為(29.41±2.114)%、(23.69±1.881)%、(20.41±3.111)%和(16.62±1.570)%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

2.3 槲皮素對C33A細胞Cyclin D1、Caspase-3 和Caspase-9蛋白表達的影響 根據(jù)前期MTT的結(jié)果，在槲皮素濃度為40 μmol/L，作用時間為48 h的條件下，對C33A的細胞活力的抑制作用比較明顯，而且細胞凋亡的作用也不至于過于強烈，因此選擇該條件來檢測槲皮素對蛋白表達的影響。與空白對照組(蛋白相對表達量分別為：0.315±0.024、0.082±0.019、0.070±0.006)相比，槲皮素(濃度為40 μmol/L)作用于C33A 細胞48 h后，Cyclin D1表達降低(0.152±0.002)，Caspase-3 和Caspase-9的表達增多(0.481±0.013、0.306±0.014)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.687、17.020、15.690，P=0.022、0.003、0.004)。詳見圖3。

圖3 槲皮素對Cyclin D1、Caspase-3 和Caspase-9蛋白表達的影響

表2 槲皮素對C33A細胞周期的影響

3 討論

槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，包括蕓香苷和槲皮苷2種糖基化形式，廣泛分布于水果、蔬菜及多種中草藥中。研究[1-3]表明，槲皮素有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎以及保護心血管等功能。本研究中，宮頸癌細胞C33A經(jīng)不同濃度槲皮素作用24 h和48 h后，C33A細胞活力同空白對照組相比出現(xiàn)了明顯的下降。上述結(jié)果表明，隨著槲皮素作用濃度的升高以及時間的延長，槲皮素抑制C33A細胞的能力也在增強。

此外，細胞周期結(jié)果顯示，C33A細胞經(jīng)不同濃度(20、40和80 μmol/L)槲皮素處理48 h后，G0/G1期細胞百分比明顯增加，而S期細胞百分比則出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)。上述結(jié)果表明，槲皮素可增加G0/G1期細胞數(shù)量，同時減少S期細胞數(shù)量，從而抑制C33A細胞的增殖。同時，Western Blot檢測結(jié)果顯示，槲皮素可下調(diào)C33A細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1的表達。因此，推測槲皮素可能是通過下調(diào)細胞中Cyclin D1蛋白的表達，阻斷細胞由G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而抑制C33A細胞的增殖和活力。

施劍明等[12]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可影響人骨肉瘤MG-63細胞的增殖及凋亡，，與順鉑聯(lián)合有協(xié)同效應(yīng)。本研究中，兩者聯(lián)合作用于C33A細胞24 h和48 h后，細胞活力分別為(31.12±2.835)%和(17.86±3.182)%，作用效果強于相同條件下兩者單獨使用，提示槲皮素可增強順鉑對C33A細胞的敏感性，與順鉑具有協(xié)同效應(yīng)。

Caspase-3 和Caspase-9作為凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白，可以誘導(dǎo)細胞進入凋亡程序。有研究[13]證實，槲皮素可通過上調(diào)Caspase-3的表達，促進人膀胱癌細胞的凋亡。本研究中，Western Blot結(jié)果顯示，槲皮素增加C33A細胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3 和Caspase-9的表達。因此，推測槲皮素可能通過提高Caspase-3 和Caspase-9的表達，促進C33A細胞凋亡。

綜上所述，槲皮素可能通過調(diào)節(jié)周期相關(guān)蛋白Cyclin D1以及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3 和Caspase-9的表達，抑制C33A細胞的增殖和活力；槲皮素還可以增強順鉑對C33A細胞的敏感性，與順鉑具有協(xié)同效應(yīng)，相關(guān)作用機制還有待進一步研究。

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