王笑燁，于軼楠，米垚川，辛爽清，梁麗

（中國醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院，遼寧省人民醫(yī)院內(nèi)分泌二科，遼寧 沈陽 110016）

2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）作為內(nèi)分泌代謝性疾病，主要與種族、環(huán)境、遺傳、生活方式等因素有關(guān)，但隨臨床不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)腸道菌群與T2DM、肥胖等代謝性疾病具有一定相關(guān)性，并指出腸道菌群參與能量代謝及BMI控制[1]。亦有學(xué)者研究報(bào)道，多數(shù)T2DM患者存在類桿菌含量降低、腸桿菌科細(xì)菌含量增多等腸道菌群失調(diào)現(xiàn)象[2]。雙歧桿菌屬專性厭氧菌，可將宿主攝入碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂肪酸，生成酸性腸道環(huán)境，競爭性排除其他致病菌，起到保護(hù)宿主的作用。GLP-1作為腸促胰島素，不僅可促進(jìn)胰島素β細(xì)胞釋放，且可抑制β細(xì)胞凋亡[3]。因此，GLP-1濃度是否正常對T2DM治療效果及預(yù)后改善等方面具有積極臨床意義。本研究選取52例T2DM患者，通過設(shè)置對照組，分析腸道雙歧桿菌菌群功能狀態(tài)與GLP-1含量變化的關(guān)聯(lián)性，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月～2017年3月本院52例T2DM患者作為研究組，男32例，女20例；年齡35～72歲，平均年齡（54.51±10.32）歲；并納入同期51名健康體檢者作為對照組，男31名，女20名；年齡34～73歲，平均年齡（53.87±10.17）歲。兩組在年齡、性別等方面對比具有均衡性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) ①納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合T2DM相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)：FBG＞7.0 mmol/L，2 h PG＞11.1 mmol/L；知情本研究，自愿簽署知情同意書。②排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肝腎等重要臟器功能障礙者；合并胃腸道疾病者；合并甲狀腺疾病、惡性腫瘤者；以往1個(gè)月內(nèi)使用抗生素及葡萄糖苷酶抑制劑者。

1.3 方法 ①腸道雙歧桿菌菌群檢測方法。取2 g濕重糞便樣品溶于滅菌PBS（20 ml），震蕩搖勻，10 min后，以3 000 r/min速度離心5 min，取上清，上述操作重復(fù)3次，以12 000 r/min速度離心10 min，棄上清，取沉淀并使用PBS（20 ml）懸浮，12 000 r/min速度離心5 min，重復(fù)3次，將洗滌后菌體用無菌水（2 ml）懸浮混勻，分別裝入2個(gè)EP管（規(guī)格為1.5 ml），12 000 r/min速度離心5 min，用于DNA提取。以嬰兒雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、長雙歧桿菌的16 SrRNA基因序列為根據(jù)，通過引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)對應(yīng)PCR引物，經(jīng)BLAST檢索證實(shí)引物特異性。以健康體檢者糞便提取細(xì)菌基因組DNA為模板，行常規(guī)PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系參數(shù)：dNTP Mixture 2 μl，10×PCR Buffer 2 μl，DNA模板3 μl，10 μmol/L 上下游引物各 0.5 μl，ddH2O 11.5 μl，5 U/μl Ex Taq酶0.5 μl；擴(kuò)增程序參數(shù)：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃延伸5 min，按照上述方式循環(huán)35次。利用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為DNA marker DL2000。將嬰兒雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、長雙歧桿菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后作為目的DNA片段，連接pMD18-T載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10宿主細(xì)胞，篩選后得到陽性克隆，制備質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后作為標(biāo)準(zhǔn)品，做10倍系列稀釋后生成1012～102拷貝/ml，行定時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系參數(shù)：SYBR premix（2×）10 μl，10 μmol/L上下游引物各0.6 μl，ddH2O 6.4 μl，模板2 μl，ROX Reference Dye（50×）0.4 μl；反應(yīng)條件：95℃變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸34 s，循環(huán)40次；融解：95 ℃15 s，60 ℃1 min，95℃15 s；冷卻：60℃15 s。每個(gè)樣品每次反應(yīng)做一復(fù)孔，做陰性與陽性對照，根據(jù)樣本Ct值與標(biāo)準(zhǔn)線計(jì)算5種細(xì)菌拷貝數(shù)。②GLP-1水平檢測方法。采集4 ml清晨空腹靜脈血，離心取上清液，通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測兩組GLP-1水平，試劑盒武漢默沙克生物科技有限公司提供，按照試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用“±s”表示，采用t檢驗(yàn)；采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組GLP-1水平對比 研究組血清GLP-1水平為（3.11±0.66）mmol/L，對照組為（5.18±0.93）mmol/L。兩組血清GLP-1水平相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.047，P=0.000），見表1。

表1 兩組GLP-1水平對比（±s，mmol/L）Table 1 Comparison of GLP-1 level in the two groups(±s,mmol/L)

表1 兩組GLP-1水平對比（±s，mmol/L）Table 1 Comparison of GLP-1 level in the two groups(±s,mmol/L)

GLP-1 3.11±0.66 5.18±0.93 13.047 0.000組別研究組對照組t值P值例數(shù)52 51

2.2 兩組腸道雙歧桿菌菌群數(shù)量對比 研究組青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌、雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌數(shù)量低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組腸道雙歧桿菌菌群數(shù)量對比（±s）Table 2 Comparison of the number of intestinal bifidobacteria in the two groups(±s)

表2 兩組腸道雙歧桿菌菌群數(shù)量對比（±s）Table 2 Comparison of the number of intestinal bifidobacteria in the two groups(±s)

P值0.000 0.000 0.000 0.042 0.000項(xiàng)目嬰兒雙歧桿菌雙歧桿菌總菌長雙歧桿菌短雙歧桿菌青春雙歧桿菌研究組（n=52）3.81±0.54 10.95±0.27 3.48±0.21 3.93±0.16 3.43±0.18對照組（n=51）4.18±0.51 11.55±0.25 3.69±0.34 4.01±0.23 4.02±0.27 t值3.573 11.696 3.779 2.052 13.072

2.3 相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析可知，T2DM患者青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌數(shù)量與GLP-1含量呈正相關(guān)（均P＜0.05），長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌與GLP-1含量無明顯相關(guān)性，見表3。

表3 相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis

3 討論

T2DM作為臨床多發(fā)疾患，占糖尿病患者90%左右[4]。大多數(shù)患者以胰島素抵抗為主要特征，但由于其早期無明顯癥狀，僅伴有口渴、輕度乏力等現(xiàn)象，多于明確診斷前并發(fā)微血管神經(jīng)等并發(fā)癥，藥物是治療T2DM有效手段，但長期服用降糖藥物具有一定副作用，長期療效欠佳[5]。

雙歧桿菌作為人體腸道重要菌群，多用于預(yù)防與治療腸道相關(guān)疾病，口服后可促使腸道有益菌生長繁殖，優(yōu)化腸道環(huán)境。研究證實(shí)，其數(shù)量減少可引起整個(gè)腸道微生態(tài)失衡、菌群失調(diào)，導(dǎo)致多種代謝性疾病出現(xiàn)[6]。加之腸道菌群數(shù)量龐大，使用傳統(tǒng)細(xì)菌定量法檢查及等待時(shí)間較長，且易受培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基、外界環(huán)境等影響，致使檢出結(jié)果存在一定誤差。故本研究采取定時(shí)熒光定量PCR方法，不僅可準(zhǔn)確、快速定量腸道菌群，且存在污染小、敏感性強(qiáng)、高通量、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢。GLP-1是一種多肽，參與糖代謝發(fā)生與發(fā)展，可通過降低β細(xì)胞高糖毒性、阻礙β細(xì)胞凋亡等方式調(diào)節(jié)β細(xì)胞數(shù)目，提高胰島β細(xì)胞功能。同時(shí)可刺激生長抑素與胰島素釋放，降低高血糖素釋放，減少肝糖原生成。此外，其在T2DM患者體內(nèi)呈低表達(dá)，若及時(shí)予以外源性GLP-1，可有效降低血糖水平，增加胰島素釋放，且不會(huì)增加低血糖等發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[7]。本研究結(jié)果顯示，研究組GLP-1水平、腸道雙歧桿菌菌群數(shù)量低于對照組（P＜0.05），提示T2DM患者體內(nèi)GLP-1濃度較低，且腸道雙歧桿菌菌群數(shù)量較少。此外，有學(xué)者研究指出，青春雙歧桿菌有助于改善2型糖尿病大鼠脂質(zhì)代謝及腸道菌群失調(diào)等現(xiàn)象[8]。本研究結(jié)果還顯示，經(jīng)Spearman相關(guān)性分析可知，T2DM患者青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌數(shù)量與GLP-1含量呈正相關(guān)（均P＜0.05），提示GLP-1含量與青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌數(shù)量密切相關(guān)，可在一定程度上反映機(jī)體代謝情況。

綜上，T2DM患者GLP-1含量與青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌數(shù)量呈正相關(guān)，可在一定程度上反映機(jī)體代謝情況。但本研究僅初步探識(shí)GLP-1含量與腸道雙歧桿菌菌群功能狀態(tài)關(guān)聯(lián)性，其具體作用機(jī)制有待臨床擴(kuò)大病例研究證實(shí)。

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