王笑燁，于軼楠，米垚川，辛爽清，梁麗

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院，遼寧省人民醫(yī)院內(nèi)分泌二科，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

2型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）作為內(nèi)分泌代謝性疾病，主要與種族、環(huán)境、遺傳、生活方式等因素有關(guān)，但隨臨床不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)腸道菌群與T2DM、肥胖等代謝性疾病具有一定相關(guān)性，并指出腸道菌群參與能量代謝及BMI控制[1]。亦有學(xué)者研究報(bào)道，多數(shù)T2DM患者存在類桿菌含量降低、腸桿菌科細(xì)菌含量增多等腸道菌群失調(diào)現(xiàn)象[2]。雙歧桿菌屬專性厭氧菌，可將宿主攝入碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂肪酸，生成酸性腸道環(huán)境，競(jìng)爭(zhēng)性排除其他致病菌，起到保護(hù)宿主的作用。GLP-1作為腸促胰島素，不僅可促進(jìn)胰島素β細(xì)胞釋放，且可抑制β細(xì)胞凋亡[3]。因此，GLP-1濃度是否正常對(duì)T2DM治療效果及預(yù)后改善等方面具有積極臨床意義。本研究選取52例T2DM患者，通過設(shè)置對(duì)照組，分析腸道雙歧桿菌菌群功能狀態(tài)與GLP-1含量變化的關(guān)聯(lián)性，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月～2017年3月本院52例T2DM患者作為研究組，男32例，女20例；年齡35～72歲，平均年齡（54.51±10.32）歲；并納入同期51名健康體檢者作為對(duì)照組，男31名，女20名；年齡34～73歲，平均年齡（53.87±10.17）歲。兩組在年齡、性別等方面對(duì)比具有均衡性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) ①納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合T2DM相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)：FBG＞7.0 mmol/L，2 h PG＞11.1 mmol/L；知情本研究，自愿簽署知情同意書。②排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肝腎等重要臟器功能障礙者；合并胃腸道疾病者；合并甲狀腺疾病、惡性腫瘤者；以往1個(gè)月內(nèi)使用抗生素及葡萄糖苷酶抑制劑者。

1.3 方法 ①腸道雙歧桿菌菌群檢測(cè)方法。取2 g濕重糞便樣品溶于滅菌PBS（20 ml），震蕩搖勻，10 min后，以3 000 r/min速度離心5 min，取上清，上述操作重復(fù)3次，以12 000 r/min速度離心10 min，棄上清，取沉淀并使用PBS（20 ml）懸浮，12 000 r/min速度離心5 min，重復(fù)3次，將洗滌后菌體用無菌水（2 ml）懸浮混勻，分別裝入2個(gè)EP管（規(guī)格為1.5 ml），12 000 r/min速度離心5 min，用于DNA提取。以嬰兒雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌的16 SrRNA基因序列為根據(jù)，通過引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)PCR引物，經(jīng)BLAST檢索證實(shí)引物特異性。以健康體檢者糞便提取細(xì)菌基因組DNA為模板，行常規(guī)PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系參數(shù)：dNTP Mixture 2 μl，10×PCR Buffer 2 μl，DNA模板3 μl，10 μmol/L 上下游引物各 0.5 μl，ddH2O 11.5 μl，5 U/μl Ex Taq酶0.5 μl；擴(kuò)增程序參數(shù)：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃延伸5 min，按照上述方式循環(huán)35次。利用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為DNA marker DL2000。將嬰兒雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后作為目的DNA片段，連接pMD18-T載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10宿主細(xì)胞，篩選后得到陽(yáng)性克隆，制備質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后作為標(biāo)準(zhǔn)品，做10倍系列稀釋后生成1012～102拷貝/ml，行定時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系參數(shù)：SYBR premix（2×）10 μl，10 μmol/L上下游引物各0.6 μl，ddH2O 6.4 μl，模板2 μl，ROX Reference Dye（50×）0.4 μl；反應(yīng)條件：95℃變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸34 s，循環(huán)40次；融解：95 ℃15 s，60 ℃1 min，95℃15 s；冷卻：60℃15 s。每個(gè)樣品每次反應(yīng)做一復(fù)孔，做陰性與陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)樣本Ct值與標(biāo)準(zhǔn)線計(jì)算5種細(xì)菌拷貝數(shù)。②GLP-1水平檢測(cè)方法。采集4 ml清晨空腹靜脈血，離心取上清液，通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)兩組GLP-1水平，試劑盒武漢默沙克生物科技有限公司提供，按照試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用“±s”表示，采用t檢驗(yàn)；采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組GLP-1水平對(duì)比 研究組血清GLP-1水平為（3.11±0.66）mmol/L，對(duì)照組為（5.18±0.93）mmol/L。兩組血清GLP-1水平相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.047，P=0.000），見表1。

表1 兩組GLP-1水平對(duì)比（±s，mmol/L）Table 1 Comparison of GLP-1 level in the two groups(±s,mmol/L)

表1 兩組GLP-1水平對(duì)比（±s，mmol/L）Table 1 Comparison of GLP-1 level in the two groups(±s,mmol/L)

GLP-1 3.11±0.66 5.18±0.93 13.047 0.000組別研究組對(duì)照組t值P值例數(shù)52 51

2.2 兩組腸道雙歧桿菌菌群數(shù)量對(duì)比 研究組青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌、雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌數(shù)量低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組腸道雙歧桿菌菌群數(shù)量對(duì)比（±s）Table 2 Comparison of the number of intestinal bifidobacteria in the two groups(±s)

表2 兩組腸道雙歧桿菌菌群數(shù)量對(duì)比（±s）Table 2 Comparison of the number of intestinal bifidobacteria in the two groups(±s)

P值0.000 0.000 0.000 0.042 0.000項(xiàng)目嬰兒雙歧桿菌雙歧桿菌總菌長(zhǎng)雙歧桿菌短雙歧桿菌青春雙歧桿菌研究組（n=52）3.81±0.54 10.95±0.27 3.48±0.21 3.93±0.16 3.43±0.18對(duì)照組（n=51）4.18±0.51 11.55±0.25 3.69±0.34 4.01±0.23 4.02±0.27 t值3.573 11.696 3.779 2.052 13.072

2.3 相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析可知，T2DM患者青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌數(shù)量與GLP-1含量呈正相關(guān)（均P＜0.05），長(zhǎng)雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌與GLP-1含量無明顯相關(guān)性，見表3。

表3 相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis

3 討論

T2DM作為臨床多發(fā)疾患，占糖尿病患者90%左右[4]。大多數(shù)患者以胰島素抵抗為主要特征，但由于其早期無明顯癥狀，僅伴有口渴、輕度乏力等現(xiàn)象，多于明確診斷前并發(fā)微血管神經(jīng)等并發(fā)癥，藥物是治療T2DM有效手段，但長(zhǎng)期服用降糖藥物具有一定副作用，長(zhǎng)期療效欠佳[5]。

雙歧桿菌作為人體腸道重要菌群，多用于預(yù)防與治療腸道相關(guān)疾病，口服后可促使腸道有益菌生長(zhǎng)繁殖，優(yōu)化腸道環(huán)境。研究證實(shí)，其數(shù)量減少可引起整個(gè)腸道微生態(tài)失衡、菌群失調(diào)，導(dǎo)致多種代謝性疾病出現(xiàn)[6]。加之腸道菌群數(shù)量龐大，使用傳統(tǒng)細(xì)菌定量法檢查及等待時(shí)間較長(zhǎng)，且易受培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基、外界環(huán)境等影響，致使檢出結(jié)果存在一定誤差。故本研究采取定時(shí)熒光定量PCR方法，不僅可準(zhǔn)確、快速定量腸道菌群，且存在污染小、敏感性強(qiáng)、高通量、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)。GLP-1是一種多肽，參與糖代謝發(fā)生與發(fā)展，可通過降低β細(xì)胞高糖毒性、阻礙β細(xì)胞凋亡等方式調(diào)節(jié)β細(xì)胞數(shù)目，提高胰島β細(xì)胞功能。同時(shí)可刺激生長(zhǎng)抑素與胰島素釋放，降低高血糖素釋放，減少肝糖原生成。此外，其在T2DM患者體內(nèi)呈低表達(dá)，若及時(shí)予以外源性GLP-1，可有效降低血糖水平，增加胰島素釋放，且不會(huì)增加低血糖等發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[7]。本研究結(jié)果顯示，研究組GLP-1水平、腸道雙歧桿菌菌群數(shù)量低于對(duì)照組（P＜0.05），提示T2DM患者體內(nèi)GLP-1濃度較低，且腸道雙歧桿菌菌群數(shù)量較少。此外，有學(xué)者研究指出，青春雙歧桿菌有助于改善2型糖尿病大鼠脂質(zhì)代謝及腸道菌群失調(diào)等現(xiàn)象[8]。本研究結(jié)果還顯示，經(jīng)Spearman相關(guān)性分析可知，T2DM患者青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌數(shù)量與GLP-1含量呈正相關(guān)（均P＜0.05），提示GLP-1含量與青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌數(shù)量密切相關(guān)，可在一定程度上反映機(jī)體代謝情況。

綜上，T2DM患者GLP-1含量與青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌數(shù)量呈正相關(guān)，可在一定程度上反映機(jī)體代謝情況。但本研究?jī)H初步探識(shí)GLP-1含量與腸道雙歧桿菌菌群功能狀態(tài)關(guān)聯(lián)性，其具體作用機(jī)制有待臨床擴(kuò)大病例研究證實(shí)。

[1] 潘寶龍,巫玲,馬潤(rùn)玫,等.脂肪因子Omentin-1、Visfatin體外表達(dá)與老年2型糖尿病胰島素抵抗的關(guān)系[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2017,37(10):2356-2359.

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