王笑燁,于軼楠,米垚川,辛爽清,梁麗
(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院,遼寧省人民醫(yī)院內(nèi)分泌二科,遼寧 沈陽(yáng) 110016)
2型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus,T2DM)作為內(nèi)分泌代謝性疾病,主要與種族、環(huán)境、遺傳、生活方式等因素有關(guān),但隨臨床不斷深入研究,發(fā)現(xiàn)腸道菌群與T2DM、肥胖等代謝性疾病具有一定相關(guān)性,并指出腸道菌群參與能量代謝及BMI控制[1]。亦有學(xué)者研究報(bào)道,多數(shù)T2DM患者存在類桿菌含量降低、腸桿菌科細(xì)菌含量增多等腸道菌群失調(diào)現(xiàn)象[2]。雙歧桿菌屬專性厭氧菌,可將宿主攝入碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂肪酸,生成酸性腸道環(huán)境,競(jìng)爭(zhēng)性排除其他致病菌,起到保護(hù)宿主的作用。GLP-1作為腸促胰島素,不僅可促進(jìn)胰島素β細(xì)胞釋放,且可抑制β細(xì)胞凋亡[3]。因此,GLP-1濃度是否正常對(duì)T2DM治療效果及預(yù)后改善等方面具有積極臨床意義。本研究選取52例T2DM患者,通過設(shè)置對(duì)照組,分析腸道雙歧桿菌菌群功能狀態(tài)與GLP-1含量變化的關(guān)聯(lián)性,報(bào)道如下。
1.1 臨床資料 選取2015年3月~2017年3月本院52例T2DM患者作為研究組,男32例,女20例;年齡35~72歲,平均年齡(54.51±10.32)歲;并納入同期51名健康體檢者作為對(duì)照組,男31名,女20名;年齡34~73歲,平均年齡(53.87±10.17)歲。兩組在年齡、性別等方面對(duì)比具有均衡性,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。
1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) ①納入標(biāo)準(zhǔn):均符合T2DM相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn):FBG>7.0 mmol/L,2 h PG>11.1 mmol/L;知情本研究,自愿簽署知情同意書。②排除標(biāo)準(zhǔn):合并肝腎等重要臟器功能障礙者;合并胃腸道疾病者;合并甲狀腺疾病、惡性腫瘤者;以往1個(gè)月內(nèi)使用抗生素及葡萄糖苷酶抑制劑者。
1.3 方法 ①腸道雙歧桿菌菌群檢測(cè)方法。取2 g濕重糞便樣品溶于滅菌PBS(20 ml),震蕩搖勻,10 min后,以3 000 r/min速度離心5 min,取上清,上述操作重復(fù)3次,以12 000 r/min速度離心10 min,棄上清,取沉淀并使用PBS(20 ml)懸浮,12 000 r/min速度離心5 min,重復(fù)3次,將洗滌后菌體用無菌水(2 ml)懸浮混勻,分別裝入2個(gè)EP管(規(guī)格為1.5 ml),12 000 r/min速度離心5 min,用于DNA提取。以嬰兒雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌的16 SrRNA基因序列為根據(jù),通過引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)PCR引物,經(jīng)BLAST檢索證實(shí)引物特異性。以健康體檢者糞便提取細(xì)菌基因組DNA為模板,行常規(guī)PCR反應(yīng),反應(yīng)體系參數(shù):dNTP Mixture 2 μl,10×PCR Buffer 2 μl,DNA模板3 μl,10 μmol/L 上下游引物各 0.5 μl,ddH2O 11.5 μl,5 U/μl Ex Taq酶0.5 μl;擴(kuò)增程序參數(shù):95℃預(yù)變性1 min,95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,72℃延伸5 min,按照上述方式循環(huán)35次。利用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為DNA marker DL2000。將嬰兒雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后作為目的DNA片段,連接pMD18-T載體,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10宿主細(xì)胞,篩選后得到陽(yáng)性克隆,制備質(zhì)粒,經(jīng)PCR鑒定后作為標(biāo)準(zhǔn)品,做10倍系列稀釋后生成1012~102拷貝/ml,行定時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)體系參數(shù):SYBR premix(2×)10 μl,10 μmol/L上下游引物各0.6 μl,ddH2O 6.4 μl,模板2 μl,ROX Reference Dye(50×)0.4 μl;反應(yīng)條件:95℃變性30 s;95 ℃變性5 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸34 s,循環(huán)40次;融解:95 ℃15 s,60 ℃1 min,95℃15 s;冷卻:60℃15 s。每個(gè)樣品每次反應(yīng)做一復(fù)孔,做陰性與陽(yáng)性對(duì)照,根據(jù)樣本Ct值與標(biāo)準(zhǔn)線計(jì)算5種細(xì)菌拷貝數(shù)。②GLP-1水平檢測(cè)方法。采集4 ml清晨空腹靜脈血,離心取上清液,通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)兩組GLP-1水平,試劑盒武漢默沙克生物科技有限公司提供,按照試劑盒說明書操作。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料采用“±s”表示,采用t檢驗(yàn);采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 兩組GLP-1水平對(duì)比 研究組血清GLP-1水平為(3.11±0.66)mmol/L,對(duì)照組為(5.18±0.93)mmol/L。兩組血清GLP-1水平相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.047,P=0.000),見表1。
表1 兩組GLP-1水平對(duì)比(±s,mmol/L)Table 1 Comparison of GLP-1 level in the two groups(±s,mmol/L)
表1 兩組GLP-1水平對(duì)比(±s,mmol/L)Table 1 Comparison of GLP-1 level in the two groups(±s,mmol/L)
GLP-1 3.11±0.66 5.18±0.93 13.047 0.000組別研究組對(duì)照組t值P值例數(shù)52 51
2.2 兩組腸道雙歧桿菌菌群數(shù)量對(duì)比 研究組青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌、雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌數(shù)量低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。
表2 兩組腸道雙歧桿菌菌群數(shù)量對(duì)比(±s)Table 2 Comparison of the number of intestinal bifidobacteria in the two groups(±s)
表2 兩組腸道雙歧桿菌菌群數(shù)量對(duì)比(±s)Table 2 Comparison of the number of intestinal bifidobacteria in the two groups(±s)
P值0.000 0.000 0.000 0.042 0.000項(xiàng)目嬰兒雙歧桿菌雙歧桿菌總菌長(zhǎng)雙歧桿菌短雙歧桿菌青春雙歧桿菌研究組(n=52)3.81±0.54 10.95±0.27 3.48±0.21 3.93±0.16 3.43±0.18對(duì)照組(n=51)4.18±0.51 11.55±0.25 3.69±0.34 4.01±0.23 4.02±0.27 t值3.573 11.696 3.779 2.052 13.072
2.3 相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析可知,T2DM患者青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌數(shù)量與GLP-1含量呈正相關(guān)(均P<0.05),長(zhǎng)雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌與GLP-1含量無明顯相關(guān)性,見表3。
表3 相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis
T2DM作為臨床多發(fā)疾患,占糖尿病患者90%左右[4]。大多數(shù)患者以胰島素抵抗為主要特征,但由于其早期無明顯癥狀,僅伴有口渴、輕度乏力等現(xiàn)象,多于明確診斷前并發(fā)微血管神經(jīng)等并發(fā)癥,藥物是治療T2DM有效手段,但長(zhǎng)期服用降糖藥物具有一定副作用,長(zhǎng)期療效欠佳[5]。
雙歧桿菌作為人體腸道重要菌群,多用于預(yù)防與治療腸道相關(guān)疾病,口服后可促使腸道有益菌生長(zhǎng)繁殖,優(yōu)化腸道環(huán)境。研究證實(shí),其數(shù)量減少可引起整個(gè)腸道微生態(tài)失衡、菌群失調(diào),導(dǎo)致多種代謝性疾病出現(xiàn)[6]。加之腸道菌群數(shù)量龐大,使用傳統(tǒng)細(xì)菌定量法檢查及等待時(shí)間較長(zhǎng),且易受培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基、外界環(huán)境等影響,致使檢出結(jié)果存在一定誤差。故本研究采取定時(shí)熒光定量PCR方法,不僅可準(zhǔn)確、快速定量腸道菌群,且存在污染小、敏感性強(qiáng)、高通量、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)。GLP-1是一種多肽,參與糖代謝發(fā)生與發(fā)展,可通過降低β細(xì)胞高糖毒性、阻礙β細(xì)胞凋亡等方式調(diào)節(jié)β細(xì)胞數(shù)目,提高胰島β細(xì)胞功能。同時(shí)可刺激生長(zhǎng)抑素與胰島素釋放,降低高血糖素釋放,減少肝糖原生成。此外,其在T2DM患者體內(nèi)呈低表達(dá),若及時(shí)予以外源性GLP-1,可有效降低血糖水平,增加胰島素釋放,且不會(huì)增加低血糖等發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[7]。本研究結(jié)果顯示,研究組GLP-1水平、腸道雙歧桿菌菌群數(shù)量低于對(duì)照組(P<0.05),提示T2DM患者體內(nèi)GLP-1濃度較低,且腸道雙歧桿菌菌群數(shù)量較少。此外,有學(xué)者研究指出,青春雙歧桿菌有助于改善2型糖尿病大鼠脂質(zhì)代謝及腸道菌群失調(diào)等現(xiàn)象[8]。本研究結(jié)果還顯示,經(jīng)Spearman相關(guān)性分析可知,T2DM患者青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌數(shù)量與GLP-1含量呈正相關(guān)(均P<0.05),提示GLP-1含量與青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌數(shù)量密切相關(guān),可在一定程度上反映機(jī)體代謝情況。
綜上,T2DM患者GLP-1含量與青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌數(shù)量呈正相關(guān),可在一定程度上反映機(jī)體代謝情況。但本研究?jī)H初步探識(shí)GLP-1含量與腸道雙歧桿菌菌群功能狀態(tài)關(guān)聯(lián)性,其具體作用機(jī)制有待臨床擴(kuò)大病例研究證實(shí)。
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