宋少良 李亞文 文亞杰 李戈輝

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院麻醉科 深圳 518020)

高糖性疾病患者對局麻藥神經(jīng)毒性具易感性[1～2]，這就造成妊娠期糖尿病的孕婦有可能在使用局麻藥物過程中出現(xiàn)神經(jīng)毒性損傷反應(yīng)[3]。機(jī)體在高血糖時存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的狀態(tài)，胞外Ca2+內(nèi)流增多，而局麻藥具有激活鈣離子通道和干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，因此使得機(jī)體出現(xiàn)鈣超載性的細(xì)胞損傷[4]。同時高血糖還會通過ERK通路引起神經(jīng)元損傷，而局麻藥也能夠進(jìn)一步激活ERK下游通路[5]。本研究針對AKT/ERK信號通路失衡狀態(tài)及伴隨的離子通道狀態(tài)改變進(jìn)行分析討論。

1 對象與方法

研究使用人未分化SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)，局麻藥(LA)損傷模型建立：對SH-SY5H細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，采用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)將培養(yǎng)的細(xì)胞分為4組，每組66孔。對照組：為SH-SY5H細(xì)胞繼續(xù)單純培養(yǎng)24h；A組(鈣離子拮抗劑米貝地爾+ SH-SY5H細(xì)胞組)：加入米貝地爾后孵育24h；B組(局麻藥布比卡因+SH-SY5H細(xì)胞組)：加入布比卡因后孵育24h；C組(米貝地爾+布比卡因+SH-SY5H細(xì)胞組)：加入米貝地爾以及布比卡因后孵育24h；米貝地爾濃度均為5umol/L,布比卡因濃度1mmol/L，葡萄糖濃度13.3mmol/L。

于不同時間點(開始時刻、孵育1h、孵育6h以及孵育24h)觀察SH-SY5H細(xì)胞活力、凋亡率，同時觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化等，以評價妊娠期糖尿病產(chǎn)婦局麻藥神經(jīng)毒性情況。統(tǒng)計分析使用SPSS20.0行統(tǒng)計分析P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀測結(jié)果

研究對SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，可見對照組細(xì)胞胞體粗大，為多角形，神經(jīng)突起多而粗，總體分布成網(wǎng)絡(luò)狀。A組細(xì)胞與對照組形態(tài)學(xué)差別不顯著，無明顯改變；B組細(xì)胞可見胞體變圓會所，神經(jīng)突起部分消失；C組則見胞體變圓，神經(jīng)突起h情況較B組略有減輕。

2.2 不同時間點細(xì)胞活力對比

研究發(fā)現(xiàn)對照組細(xì)胞在4個不同的時間點細(xì)胞活力未見明顯改變；A組細(xì)胞在4個時間點的細(xì)胞活力變動也不大；均有P>0.05；B組細(xì)胞以及C組細(xì)胞可見隨著孵育進(jìn)程細(xì)胞活力逐漸減低，特別是B組細(xì)胞活力減退顯著；B、C組細(xì)胞在孵育1h、孵育6h以及孵育24h時間點的細(xì)胞活力均顯著低于開始時刻水平均有P<0.05，見表1。

表1 不同時間點細(xì)胞活力對比

A組B組C組對照組開始時刻100100100100孵育1h92±1280±10?#88±11?#96±11孵育6h94±1132±9?#67±12?#93±13孵育24h90±1326±8?#57±11?#90±13

注：*與開始時刻比較，P<0.05；#與對照組比較，P<0.05。

2.3 不同時間點細(xì)胞凋亡率對比

研究中在4個不同的時間點對比4組細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果提示對照組和使用米貝地爾的A組細(xì)胞凋亡未見明顯改變；P>0.05；與此同時B組細(xì)胞以及C組細(xì)胞可見隨著孵育進(jìn)程細(xì)胞凋亡率逐漸增加，特別是B組細(xì)胞最為顯著；B、C組細(xì)胞在孵育1h、孵育6h以及孵育24h時間點的細(xì)胞凋亡率均顯著高于開始時刻水平；均有P<0.05，見表2。

3 討論

妊娠期糖尿病的出現(xiàn)與孕婦機(jī)體營養(yǎng)過剩以及在代謝刺激下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生變化關(guān)聯(lián)密切；而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)體系的受損會形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致活性氧(reactive oxygen species,ROS)在細(xì)胞中的毒性不斷積累，長期持續(xù)就會引發(fā)細(xì)胞凋亡[7～10]。本研究結(jié)果提示對照組細(xì)胞胞體粗大，為多角形，神經(jīng)突起多而粗，總體分布成網(wǎng)絡(luò)狀。A組細(xì)胞與對照組形態(tài)學(xué)差別不顯著，無明顯改變；B組細(xì)胞可見胞體變圓會所，神經(jīng)突起部分消失；C組則見胞體變圓，神經(jīng)突起情況較B組略有減輕。

表2 不同時間點細(xì)胞凋亡率對比

A組B組C組對照組開始時刻7．1±2．36．8±2．07．0±2．06．9±1．9孵育1h7．4±2．215．7±2．3?#9．1±2．2?#7．2±2．1孵育6h6．8±2．132．4±2．4?#18．3±2．3?#6．7±2．0孵育24h6．9±2．341．1±2．2?#20．1±2．1?#6．9±2．2

注：*與開始時刻比較，P<0.05；#與對照組比較，P<0.05。

基于機(jī)體在高血糖時存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，Ca2+通道異常；以及高血糖會通過ERK通路引起神經(jīng)元損傷的理論基礎(chǔ)[11～12]，本研究針對AKT/ERK信號通路失衡狀態(tài)及伴隨的離子通道狀態(tài)改變進(jìn)行分析討論，發(fā)現(xiàn)對照組細(xì)胞在4個不同的時間點細(xì)胞活力未見明顯改變；米貝地爾組細(xì)胞在4個時間點的細(xì)胞活力變動也不大。與此同時使用布比卡因的B組細(xì)胞以及米貝地爾、布比卡因聯(lián)用的C組細(xì)胞可見隨著孵育進(jìn)程細(xì)胞活力逐漸減低，特別是B組細(xì)胞活力減退顯著；B、C組細(xì)胞在孵育1h、孵育6h以及孵育24h時間點的細(xì)胞活力均顯著低于開始時刻水平。從凋亡的角度來分析在4個不同的時間點對比凋亡率，B組細(xì)胞以及C組細(xì)胞可見隨著孵育進(jìn)程細(xì)胞凋亡率逐漸增加，特別是B組細(xì)胞最為顯著；B、C組細(xì)胞在孵育1h、孵育6h以及孵育24h時間點的細(xì)胞凋亡率均顯著高于開始時刻水平。

總之，AKT/ERK信號通路在高糖環(huán)境和局麻藥可能發(fā)生協(xié)同作用下對離子通道產(chǎn)生影響。妊娠期糖尿病產(chǎn)婦使用局麻藥物進(jìn)行手術(shù)或鎮(zhèn)痛出現(xiàn)藥物神經(jīng)毒性損害需引起臨床關(guān)注，并給于恰當(dāng)防治。

1 苗銀鳳,李偉.妊娠期糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)及治療.實用婦科內(nèi)分泌電子雜志,2017,4(5):16～17.

2 豐樹煥.高脂高糖誘導(dǎo)妊娠大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的變化及飲食干預(yù)后的影響.鄭州大學(xué),2015.

3 李亞文,徐世元,張慶國,等.布比卡因?qū)Ω咛桥囵B(yǎng)SH-SY5Y 細(xì)胞毒性研究.重慶醫(yī)學(xué),2015,10(18):2449～2450.

4 王艷,趙鵬偉,韓志強(qiáng).高糖代謝引發(fā)神經(jīng)毒性的作用機(jī)制研究進(jìn)展.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2017,26(18):2046～2049.

5 季中華,劉紫庭,李樂,等.糖尿病周圍神經(jīng)病變對大鼠局麻藥外周神經(jīng)毒性的影響.中華麻醉學(xué)雜志,2016,36(10):1250～1253.

6 劉瑤霞,陳平.高血糖神經(jīng)毒性研究進(jìn)展.西部醫(yī)學(xué),2009,21(10):1804～1805.

7 黃飛,王顯勛,石曉兵,等.妊娠期糖尿病對孕期骨代謝影響的探討.數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2011,24(2):157～158.

8 李亞文.高糖環(huán)境誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞ROS爆發(fā)-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增強(qiáng)布比卡因神經(jīng)毒性.南方醫(yī)科大學(xué),2013.

9 李亞文,徐世元,張慶國,等.布比卡因致高糖培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增強(qiáng)與活性氧簇增多及凋亡增加.國際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志,2014,35(3):241～245.

10 馮亮群.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在羅哌卡因誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡中的作用.中國藥業(yè),2015,22(17):13～15.

11 李宗澤.肌肽對高糖誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用.遼寧醫(yī)學(xué)院,2014.