范奎奎，李 強(qiáng)，楊文雅，潘 登，李海軍，杜晨光,2*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 呼和浩特 010018； 2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 包頭014109)

Western blot是目前定量分析生物組織蛋白質(zhì)表達(dá)最常用的方法之一，但試驗(yàn)步驟繁雜，致使人們投入巨大精力卻常常遇到條帶不整齊、結(jié)果不穩(wěn)定且重復(fù)性差等問題[1-2]。通常，蛋白樣本的提取質(zhì)量及轉(zhuǎn)膜電壓、功率是該技術(shù)的關(guān)鍵[3-5]。

有試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)膜液中十二烷基磺酸鈉(SDS)含量會(huì)影響轉(zhuǎn)膜電壓及功率[6]；同時(shí)，影響轉(zhuǎn)膜液工作電壓及功率的另一重要因素為溶液pH，當(dāng)轉(zhuǎn)膜液pH高于或低于蛋白等電點(diǎn)2個(gè)pH時(shí)才會(huì)發(fā)生蛋白轉(zhuǎn)移，過高或過低都不能使得蛋白有效轉(zhuǎn)移[7-8]。但均未給出相應(yīng)量級(jí)變化和影響轉(zhuǎn)膜電壓及功率大小的趨勢。對(duì)于低豐度表達(dá)的蛋白[7]，如黑皮質(zhì)素-4型受體(Melanocortin-4-receptor, MC4R)等，因其發(fā)揮抑制攝食和體重增加及促進(jìn)機(jī)體能量消耗的功能，成為研究的新熱點(diǎn)，但鑒定較為困難，除受轉(zhuǎn)膜電壓及功率的影響外[8]，還受到蛋白樣本提取本身質(zhì)量及效率的影響[9]，對(duì)于組織蛋白提取，目前有研究表明，生物化學(xué)試劑對(duì)于組織細(xì)胞本身的裂解、破膜、及蛋白釋放的作用，強(qiáng)于機(jī)械性破碎，高效裂解液對(duì)于鑒定低豐度蛋白表達(dá)很重要[10]。同時(shí)，對(duì)于MC4R蛋白的表達(dá)，也僅有N. X. Cawry等和L.D. Faulkner等[11-12]有所報(bào)道，但并未得到有效重復(fù)。

基于轉(zhuǎn)膜液中SDS的含量及溶液pH對(duì)轉(zhuǎn)膜電壓及功率的影響，本試驗(yàn)分別以0、0.3和1 g·L-1SDS含量的轉(zhuǎn)膜液于350、380及400 mA恒流濕轉(zhuǎn)90 min，檢測轉(zhuǎn)膜液SDS含量對(duì)轉(zhuǎn)膜電壓及功率的影響，同時(shí)設(shè)定pH7.6、8.0、8.3和8.6的轉(zhuǎn)膜液，以研究不同pH轉(zhuǎn)膜液對(duì)蛋白轉(zhuǎn)膜電壓及功率的影響，并在獲得相關(guān)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上比較提高裂解強(qiáng)度對(duì)MC4R表達(dá)的作用效果，以期有助于相關(guān)操作人員對(duì)具體細(xì)節(jié)的認(rèn)識(shí)，并有助于鑒定低豐度表達(dá)蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡C57/BL6小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。頸椎脫臼法處死小鼠，并獲取背肩胛棕色脂肪組織(Brown adipose tissue, BAT)材料，生理鹽水洗去血跡后，混合少量裂解液凍存于-80 ℃ 冰箱備用。

1.2 方法

常規(guī)方法制作5%濃縮膠和13%分離膠，相關(guān)藥品均購置于Sigma，凝膠置于電泳液4 ℃平衡過夜后備用。

基礎(chǔ)裂解液為RIPA(康為世紀(jì) CW2333S)，組織置于冰上，添加少量裂解液用電動(dòng)研磨杵研磨，然后補(bǔ)齊至500 μL裂解液，冰上孵育30 min，每5 min旋渦30 s，然后以超聲強(qiáng)度95 V，單次處理15 s，共做3次 (QSONICA Q700)處理，再繼續(xù)孵育10 min，12 000 r·min-1離心轉(zhuǎn)移上清至新管，二次以超聲強(qiáng)度95 V，單次處理15 s，做1次處理；12 000 r·min-1離心轉(zhuǎn)移上清至新管，BCA工作液測定蛋白濃度，調(diào)整濃度至2.0 μg·μL-1，上樣體積20 μL。

電泳裝置(Bio-Rad電泳系統(tǒng))于冰中分級(jí)恒壓(80 V，28 min; 140 V，90 min)電泳后，首先，分別以0、0.3和1 g·L-1SDS的轉(zhuǎn)膜液(通用pH8.3)，然后根據(jù)轉(zhuǎn)膜液SDS結(jié)果，以pH7.6、8.0和8.6的轉(zhuǎn)膜液于350、380及400 mA恒流濕轉(zhuǎn)90 min，分別記錄轉(zhuǎn)膜電壓，電轉(zhuǎn)裝置于冰中及磁力攪拌器均勻攪拌轉(zhuǎn)膜。

所需液體配方參見 Cell Signaling Technology Western Blotting Protocol (Fluorescent)。

選取效果較好的SDS含量和pH的轉(zhuǎn)膜液進(jìn)行后續(xù)抗體孵育試驗(yàn)比較不同裂解液的效果。轉(zhuǎn)印后膜用5% 脫脂奶粉(Nonfat dry milk)室溫封閉1 h，TBST清洗3×10 min孵育一抗及相應(yīng)二抗。先后孵育一抗順序：Anti-MC4 Receptor antibody(Abcam, Rabbit, 1∶500, ab24233)，pERK(CST, Mouse, 1∶1 000, 4370)，GAPDH (Abcam, Rabbit,1∶10 000, ab181602) 4 ℃過夜孵育，TBST清洗3×10 min 后孵育二抗，IR800(1∶20 000，IRDye?800 CW Goat anti-Rabbit, Odyssey)和IR680(1∶20 000,IRDye?680LT Goat anti-Mouse, Odyssey)室溫孵育1 h，TBST清洗3×10 min，于LI-COR Odyssey CLX進(jìn)行掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行單因子方差(One-way ANOVA)分析和Tukey′s Multiple Comparison test 統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± SEM)”表示。*為差異顯著(P<0.05)，**和***為差異極顯著(P<0.01，P<0.001)。

2 結(jié) 果

2.1 不同SDS濃度轉(zhuǎn)膜液對(duì)初始轉(zhuǎn)膜電壓的影響

由圖1可知，350、380和400 mA恒流轉(zhuǎn)膜過程中，0 g·L-1SDS轉(zhuǎn)膜液的初始轉(zhuǎn)膜電壓及功率極顯著高于1 g·L-1SDS轉(zhuǎn)膜液(P<0.05)，但0.3 與0 g·L-1SDS組間無顯著性差異(n.s)?？紤]到SDS影響蛋白與膜結(jié)合的關(guān)系，為保證轉(zhuǎn)膜電壓和蛋白轉(zhuǎn)印效率(蛋白和膜的結(jié)合能力)，選取0.3 g·L-1SDS進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

n.s.差異不顯著。下同n.s. No significant difference. The same as below圖1 不同SDS濃度轉(zhuǎn)膜液對(duì)初始轉(zhuǎn)膜電壓的影響Fig.1 Effect of different concentration SDS of transfer buffer on initial voltage of electrotransfer

2.2 不同pH轉(zhuǎn)膜液對(duì)初始轉(zhuǎn)膜電壓的影響

由圖2可知，pH為8.0時(shí)的初始轉(zhuǎn)膜電壓及功率顯著高于pH 8.3組(P<0.05)，極顯著高于pH7.6和pH8.6的轉(zhuǎn)膜液轉(zhuǎn)膜電壓(P<0.01，P<0.001)，pH 8.6的轉(zhuǎn)膜電壓功率為pH8.0轉(zhuǎn)膜電壓功率的一半左右。恒流轉(zhuǎn)膜時(shí)，隨著時(shí)間延長，電壓逐漸降低，轉(zhuǎn)膜液的pH對(duì)初始轉(zhuǎn)膜電壓及功率有著積極的影響(圖2)。因此，選取pH8.0轉(zhuǎn)膜液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)的抗體孵育效果比較。

圖2 不同pH轉(zhuǎn)膜液對(duì)初始轉(zhuǎn)膜電壓的影響Fig.2 Effect of different pH in transfer buffer on initial voltage of electrotransfer

2.3 不同蛋白裂解液對(duì)MC4R及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

由于鑒定膜蛋白表達(dá)困難，在未知轉(zhuǎn)膜液中SDS含量及pH的作用效果前，通常轉(zhuǎn)膜效果時(shí)好時(shí)壞，穩(wěn)定性差。在獲得上述基礎(chǔ)數(shù)據(jù)后，試驗(yàn)以0.3 g·L-1SDS的轉(zhuǎn)膜液(pH 8.0)、400 mA轉(zhuǎn)印90 min為基礎(chǔ)，進(jìn)行蛋白提取裂解液的比較。由圖3可知，不同裂解液及處理方法對(duì)MC4R蛋白(37 ku)表達(dá)有很大影響，裂解液混合醇類的組合即(20%Methanol+1%Triton+1%SDS+RIPA)處理組顯著優(yōu)于單獨(dú)RIPA的處理組(P<0.05)，極顯著優(yōu)于Trizol處理組(P<0.01)，且該處理組幾近沒有陽性條帶。內(nèi)參GAPDH和細(xì)胞信號(hào)通路蛋白pERK均呈現(xiàn)類似趨勢。提示含有醇類物混合裂解液有利于脂肪蛋白的提取。圖中55 ku附近為脂肪組織在鼠源熒光信號(hào)下特定的非特異性雜帶。

A. MC4R、GAPDH、pERK結(jié)果：×××××××為非特異性雜帶；B. MC4R；C. GAPDH;D.pERKA. Expression of MC4R，GAPDH，pERK: ××××××× is the non-specific bands; B. MC4R; C.GAPDH; D. pERK圖3 不同裂解液處理組MC4R、pERK、GAPDH的表達(dá)差異Fig.3 Expression difference of MC4R，pERK，GAPDH treated with different lysis

3 討 論

作為Western blot技術(shù)的關(guān)鍵影響因素，轉(zhuǎn)膜電壓導(dǎo)致的轉(zhuǎn)膜功率很大程度影響著最終試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性[13-14]。轉(zhuǎn)膜液中SDS含量可影響蛋白電轉(zhuǎn)的效率，同時(shí)影響蛋白和膜的結(jié)合能力，不恰當(dāng)?shù)腟DS含量既不能達(dá)到提高轉(zhuǎn)膜效率的目的，而且還會(huì)影響最終結(jié)合到膜上的有效蛋白，進(jìn)而影響最后的結(jié)果[13]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，恒流轉(zhuǎn)膜時(shí)，轉(zhuǎn)膜液中SDS含量與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜電壓及功率呈反比，即轉(zhuǎn)膜液中SDS含量越高，轉(zhuǎn)膜電壓及功率越低。SDS在轉(zhuǎn)膜液中的含量為0.3 g·L-1時(shí)，即最終的工作濃度為0.03%，既能有效的增高轉(zhuǎn)膜的電壓及功率，又不影響最終蛋白和膜的結(jié)合，有效保證膜上有效蛋白的含量。

研究表明，蛋白有效轉(zhuǎn)移的發(fā)生是基于蛋白本身等電點(diǎn)和轉(zhuǎn)移緩沖液之間的pH差，只有當(dāng)緩沖液pH高于或低于蛋白本身等電點(diǎn)時(shí)才能有效轉(zhuǎn)移[3, 8, 15]。轉(zhuǎn)膜液pH對(duì)轉(zhuǎn)膜電壓及功率的影響與SDS含量對(duì)電壓的影響極為相似，需維持在一個(gè)穩(wěn)定合適的范圍[3, 8]，本試驗(yàn)中，無論是pH為偏酸性的7.6，亦或是偏堿性8.6的轉(zhuǎn)膜液，轉(zhuǎn)膜電壓及功率都明顯過低，同樣影響了最終轉(zhuǎn)膜的效率及膜上蛋白的多少，而pH8.0的溶液，與上述兩類pH的溶液相比較，轉(zhuǎn)膜效率明顯增高。提示，轉(zhuǎn)膜液的pH應(yīng)該穩(wěn)定在以8.0為基準(zhǔn)的區(qū)間內(nèi)，從而保證轉(zhuǎn)膜的效率。對(duì)于較大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，也可通過適當(dāng)延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間增加電流強(qiáng)度來提高轉(zhuǎn)膜效率。

MC4R具有7次跨膜結(jié)構(gòu)，為G-蛋白耦聯(lián)受體家族成員，是一類調(diào)節(jié)能量動(dòng)態(tài)平衡的重要信號(hào)分子，廣泛存在于動(dòng)物機(jī)體中[16-18]，通常表達(dá)豐度較低。加之現(xiàn)有商品化抗體效價(jià)不佳，特異性較差[19-21]，其提取方式和效率的差異[22-23]最終會(huì)影響檢測的靈敏性和準(zhǔn)確性，通用蛋白裂解液僅對(duì)豐度較高、抗體特異性強(qiáng)的蛋白的提取效果較好，但對(duì)于像MC4R這樣低豐度表達(dá)的蛋白而言，已知商品化的裂解液并不能完全達(dá)到預(yù)期效果[24-26]，而現(xiàn)有結(jié)果表明，裂解液成分及處理方法對(duì)鑒定MC4R表達(dá)的影響有著重要作用[27-28]，對(duì)于BAT組織MC4R表達(dá)而言，其中醇類物 20%Methanol+1%Triton+1%SDS+RIPA處理組與RIPA及Trizol的處理組相比效果極為顯著，推測，針對(duì)脂肪組織中像MC4R類似低豐度表達(dá)的蛋白提取而言，含有醇類物的混合裂解液更為適合。高豐度表達(dá)蛋白pERK和GAPDH的表達(dá)趨勢也支持這種推斷。

綜上，轉(zhuǎn)膜液SDS含量及溶液本身pH的初步確定，配合混合增強(qiáng)裂解液處理BAT組織的方法，為鑒定低豐度蛋白表達(dá)提供了一種選擇，有效提高了該技術(shù)的靈敏性與穩(wěn)定性，但必須看到，該方法并不一定適用于眾多低豐度表達(dá)蛋白，鑒定特異組織、特異蛋白時(shí)仍需摸索有效步驟。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)探明了轉(zhuǎn)膜液中SDS含量與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜電壓及功率呈反比的關(guān)系，并確定了工作濃度為0.03%。對(duì)于BAT組織中MC4R的表達(dá)而言，醇類物 20%Methanol+1%Triton+1%SDS+RIPA處理效果最優(yōu)，并提示對(duì)脂肪組織中像MC4R類似低豐度表達(dá)蛋白的抽提使用醇類物混合裂解液更為合適。上述結(jié)果有助于相關(guān)操作人員對(duì)主要細(xì)節(jié)的認(rèn)識(shí)，有助于理解Western blot鑒定脂肪組織低豐度蛋白試驗(yàn)的靈敏及重復(fù)性。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] JIANG Y, HOU X X, GENG Z, et al. Interpretation criteria for standardized Western blot for the predominant species ofBorreliaburgdorferisensulatoin China[J].BiomedEnvironSci, 2010, 23(5): 341-349.

[2] 董 燕, 張 楓, 梅柱中, 等. 電轉(zhuǎn)移中蛋白質(zhì)的透膜現(xiàn)象及其對(duì)蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的影響[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2002, 29(3): 449-453.

DONG Y, ZHANG F, MEI Z Z, et al. Protein blowthrough in electrophoretic transfer and its effects on Western blotting[J].ProgressinBiochemistryandBiophysics, 2002, 29(3): 449-453. (in Chinese)

[3] DEGASPERI A, BIRTWISTLE M R, VOLINSKY N, et al. Evaluating strategies to normalise biological replicates of Western blot data[J].PLoSOne, 2014, 9(1): e87293.

[4] EATON S L, ROCHE S L, HURTADO M L, et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting[J].PLoSOne, 2013, 8(8): e72457.

[5] GHOSH R, GILDA J E, GOMES A V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of Western blots[J].ExpRevProteomics, 2014, 11(5): 549-560.

[6] HEDA G D, OMOTOLA O B, HEDA R P, et al. Effects of reusing gel electrophoresis and electrotransfer buffers on Western blotting[J].JBiomolTech, 2016, 27(3): 113-118.

[7] 謝 嵐, 艾 華. Western blot方法中不同電流強(qiáng)度對(duì)較大分子蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜效率的影響[J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 33(1): 42-44.

XIE L, AI H. Effects of different current densities on efficiency of electrotransfer for the large-molecular-weight protein in Western blot assay[J].InternationalJournalofLaboratoryMedicine, 2012, 33(1): 42-44. (in Chinese)

[8] PENNA A, CANHALAN M. Western blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels[J].JVisExp, 2007(7): 264.

[9] ABEYRATHNE P D, LAM J S. Conditions that allow for effective transfer of membrane proteins onto nitrocellulose membrane in Western blots[J].CanJMicrobiol, 2007, 53(4): 526-532.

[10] COLLINS M A, AN J Y, PELLER D, et al. Total protein is an effective loading control for cerebrospinal fluid Western blots[J].JNeurosciMethods, 2015, 251: 72-82.

[11] CAWRY N X, YANIK T, WORONOWICA A, et al. Obese carboxypeptidase E knockout mice exhibit multiple defects in peptide hormone processing contributing to low bone mineral density[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab, 2010, 299(2): E189-E197.

[12] FAULKNER L D, DOWLING A R, STUART R C, et al. Reduced melanocortin production causes sexual dysfunction in male mice with POMC neuronal insulin and leptin insensitivity[J].Endocrinology, 2015, 156(4): 1372-1385.

[13] KURIEN B T, SCOFIELD R H. Western blotting of high and low molecular weight proteins using heat[M]//KURIENR B T, SCOFIELD R H. Western Blotting: Methods and Protocols. New York, NY: Humana Press, 2015: 247-255.

[14] JIN S, FURTAW M D, CHEN H X, et al. Multiplexed Western blotting using microchip electrophoresis[J].AnalChem, 2016, 88(13): 6703-6710.

[16] MORGAN D A, MCDANIEL L N, YIN T, et al. Regulation of glucose tolerance and sympathetic activity byMC4R signaling in the lateral hypothalamus[J].Diabetes, 2015, 64(6): 1976-1987.

[17] 黃 萌, 賢 明, 史明艷, 等.MC4R基因沉默對(duì)牛成纖維細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2017, 48(3): 403-415.

HAUNG M, XIAN M, SHI M Y, et al. Effects ofMC4R gene silencing on gene expression in bovine fibroblast cells[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2017, 48(3): 403-415. (in Chinese)

[18] 張 菊, 杜立新, 李宏濱, 等. 綿羊MC4R基因的半定量RT-PCR及生物信息學(xué)分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2010, 41(7): 804-810.

ZHANG J, DU L X, LI H B, et al. Semi-quantitative RT-PCR and bioinformatics analysis of sheepMC4R gene[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2010, 41(7): 804-810. (in Chinese)

[19] TREINDL F, RUPRECHT B, BEITER Y, et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses[J].NatCommun, 2016, 7: 12852.

[20] HEMMATZADEH F, KAZEMIMANESH M. Detection of specific antigens of Newcastle disease virus using an absorbed Western blotting method.[J].IranJVetRes, 2017, 18(2): 92-96.

[21] GILDA J E, GHOSH R, CHEAH J X, et al. Western blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS)[J].PLoSOne, 2015, 10(8): e0135392.

[22] LEIMGRUBER R M, MALONE J P, RADABAUGH M R, et al. Development of improved cell lysis, solubilization and imaging approaches for proteomic analyses[J].Proteomics, 2002, 2(2): 135-144.

[24] SINKALA E, SOLLIER-CHRISTEN E, RENIER C, et al. Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic Western blotting[J].NatCommun, 2017, 8: 14622.

[25] OKITA N, HIGAMI Y, FUKAI F, et al. Modified Western blotting for insulin and other diabetes-associated peptide hormones[J].SciRep, 2017, 7: 6949.

[26] MERPHY R M, LAMB G D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes[J].JPhysiol, 2013, 591(23): 5823-5831.

[27] HEDA G D, OMOTOLA O B, HEDA R P, et al. Effects of reusing gel electrophoresis and electrotransfer buffers on Western blotting[J].JBiomolTech, 2016, 27(3): 113-118.

[28] MARANGONI A, FOSCHI C, CAPRETTI M G, et al. Contribution of a comparative Western blot method to early postnatal diagnosis of congenital syphilis[J].ClinVaccineImmunol, 2016, 23(5): 410-416.