董建國，王 瑞，曲哲會(huì)，趙 瑜，劉 濤

(信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院，信陽 464000)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病[1]，以排水樣糞便、嘔吐、脫水和食欲下降、精神沉郁為主要特征。對剛出生的仔豬危害最大。該病于1971年在英國首次暴發(fā)，隨后瑞士、法國、中國、日本、朝鮮和美國等國家均發(fā)生該病，呈地方流行性[2-5]。PEDV是有囊膜的RNA病毒，屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬成員。PEDV基因組全長28 kb左右，包括7個(gè)開放閱讀框，它們分別編碼四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(S、E、M和N)及三個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(pp1a、pp1ab和ORF3)。PEDV S蛋白由1 383個(gè)氨基酸組成，是最大的結(jié)構(gòu)蛋白。S蛋白是糖蛋白，位于病毒粒子表面[6]。有研究表明S蛋白能夠激活宿主產(chǎn)生中和抗體。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)四個(gè)中和表位(COE：aa 499—638，SS2：aa 748—755，SS6：aa 764—771，2C10：aa 1 368—1 374)[7-9]。因此，S蛋白在PEDV遺傳演化中具有重要作用。

2010年以前，PED在中國呈散發(fā)狀態(tài)。但是，2010年以后，新的變異毒株在中國許多地區(qū)出現(xiàn)，導(dǎo)致剛出生小豬嚴(yán)重腹瀉，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PEDV變異毒株能夠引起1～10日齡仔豬幾乎100%的感染率和80%～100%的致死率[10-11]。河南是中國中部養(yǎng)豬最多的省份，但是近些年部分豬場發(fā)生PED，導(dǎo)致大規(guī)模的仔豬死亡。因此，本研究調(diào)查了最近河南地區(qū)不同PEDV分離株S基因的改變情況，以便進(jìn)一步了解該地區(qū)PEDV的流行病學(xué)，為疾病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料

河南省各地區(qū)疑似暴發(fā)PEDV的自然發(fā)病豬，采集發(fā)病豬腸道組織及內(nèi)容物，無菌處理，于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞和菌體

所用宿主菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞由信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.3 主要試劑

病毒DNA/RNA提取試劑盒購自Magen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega公司；RT-PCR相關(guān)試劑盒購自TOYOBO生物科技有限公司和Vazyme公司；DNA Marker DL2000等購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自Promega公司；EB替代染料，；pEASY-Blunt Simple Cloning Vector和Trans-5α感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)布的CV777和近些年發(fā)布的PEDV變異毒株序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)4對特異性引物，將S基因分成4個(gè)片段(S1、S2、S3、S4)進(jìn)行擴(kuò)增，每兩段之間有一部分重疊區(qū)域，引物由上海生工生物工程公司合成。引物信息見表1。

表1PEDVS基因擴(kuò)增引物序列

Table1SequencesofamplifiedPEDVSgene

名稱Name序列(5'→3')Sequence擴(kuò)增大小/bpAmplificationsizeS1FTAGTGATGTTGTGTTAGGCTTGTTG1054S1RAGGATCTGAGGAATTACTGCAAACS2FCATACTGCTTTAGGAACAAATCTT1039S2RACAACTGTCCAGAATCAGATGTATAS3FTTATTACCCTTACAAATTCTAGC1083S3RGACTAATAGCCTCTTTAACACTCTS4FGCTGAGTCTTTTAACTCTGCTAT1200S4RAGACTTCGAGACATCTTTGACA

1.5 核酸提取及目的基因反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增

將處理的病料根據(jù)Magen公司產(chǎn)品試劑盒進(jìn)行病毒核酸的提取，然后根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以四個(gè)片段的下游引物進(jìn)行病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增合成cDNA。運(yùn)用TaKaRa高保真酶擴(kuò)增S基因，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶大小。

1.6 基因克隆和序列分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，使用Promega公司膠回收試劑盒對目的片段進(jìn)行膠回收，然后連接到北京全式金生物有限公司的pEASY-Blunt Simple Cloning Vector上，經(jīng)過轉(zhuǎn)化挑菌鑒定后送往測序公司進(jìn)行測序。將測序正確的序列運(yùn)用Lasergene的SeqMan軟件進(jìn)行序列拼接，隨后用于Lasergene的Meglian軟件和Mega5.0對全長S基因進(jìn)行序列比對分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

將所獲得的PEDVS基因核苷酸序列均上傳至GenBank。

2 結(jié) 果

2.1 S基因核苷酸序列

38株P(guān)EDV臨床樣品信息和S基因擴(kuò)增片段大小見表2，S基因在GenBank中的編號為KY211038到KY211075。

表2臨床樣品信息和擴(kuò)增片段大小

Table2Clinicalsampleinformationandamplificationfragmentsize

序號No.名稱Designation地區(qū)AreaGenBank登錄號AccessionNo.擴(kuò)增大小/bpAmplificationsize1PDS1S平頂山PingdingshanKY21105240732PDS2S平頂山PingdingshanKY21105341613LY1S平頂山PingdingshanKY21104141614XC1S許昌XuchangKY21105441105XC2S許昌XuchangKY21105541616XX1S新鄉(xiāng)XinxiangKY21105641617JZ1S焦作JiaozuoKY21103841618LH1S漯河LuoheKY21103941619LH2S漯河LuoheKY211040416110ZMD2S駐馬店ZhumadianKY211066416111ZMD3S駐馬店ZhumadianKY211067416112ZMD4S駐馬店ZhumadianKY211068411013ZMD5S駐馬店ZhumadianKY211069411014ZMD7S駐馬店ZhumadianKY211070411015ZMD8S駐馬店ZhumadianKY211071411016ZMD9S駐馬店ZhumadianKY211072411017ZMD10S駐馬店ZhumadianKY211073416118ZMD11S駐馬店ZhumadianKY211074416119ZMD12S駐馬店ZhumadianKY211075416120NY1S南陽NanyangKY211042417921NY2S南陽NanyangKY211043416122NY3S南陽NanyangKY211044416123NY4S南陽NanyangKY211045411024NY5S南陽NanyangKY211046417925NY6S南陽NanyangKY211047416126NY7S南陽NanyangKY211048416127NY8S南陽NanyangKY211049411028NY9S南陽NanyangKY211050415829NY10S南陽NanyangKY211051411030XY1S信陽XinyangKY211057416131XY2S信陽XinyangKY211058416132XY3S信陽XinyangKY211059411033XY4S信陽XinyangKY211060411034XY5S信陽XinyangKY211061415835XY6S信陽XinyangKY211062416736XY7S信陽XinyangKY211063416137XY8S信陽XinyangKY211064411038XY9S信陽XinyangKY2110654110

2.2 S基因的演化分析

運(yùn)用MEGA5.2軟件對S基因的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析。如圖1所示，擴(kuò)增的PEDVS基因片段均屬于Group2，DR13毒株和CV777毒株屬于Group1。Group2又進(jìn)一步的被分為五個(gè)亞組，ZMD10/11S、PDS1/2S、NY9S和XY5S這幾個(gè)PEDVS基因片段與GD-1、CHGD-01親緣性較近，屬于Subgroup2；LY1S、NY1/5S、XY2S與變異毒株BJ-2011-1、AH2012、AJ1102親緣關(guān)系近，屬于Subgroup3；擴(kuò)增的S基因片段ZMD3/4/5/7/8/9S、XY1/4/6S、NY2/3/4/6/7/10S和LH2S與USA Colorado 2013變異毒株親緣關(guān)系較近，屬于Subgroup4；其他擴(kuò)增的S基因片段與PEDV CH ZMDZY 11有更近的親緣關(guān)系，屬于Subgroup5。

2.3 S蛋白氨基酸變異分析

為了深入了解S基因的特性，運(yùn)用MegAlign軟件對所有擴(kuò)增的S基因編碼的S蛋白的氨基酸序列與參考毒株進(jìn)行比對分析。結(jié)果顯示：擴(kuò)增的S基因片段之間核苷酸序列的相似性在96.0%～100%；編碼的氨基酸序列的相似性在94.7%～100%；擴(kuò)增的S基因片段與參考毒株之間核苷酸序列的相似性為84.6%～100%；編碼的氨基酸序列的相似性為79.3%～100%。與經(jīng)典毒株CV777、LZC相比，所有擴(kuò)增的S基因編碼的S蛋白在第55—58氨基酸位點(diǎn)均有5個(gè)氨基酸的插入，在第159—160氨基酸位點(diǎn)有2個(gè)氨基酸的缺失。與其他分離的PEDV不同的是，NY1/5S的S蛋白在第358—363氨基酸位點(diǎn)有6個(gè)氨基酸的插入，XY6S的S蛋白在第393—394氨基酸位點(diǎn)有2個(gè)氨基酸的插入。除了經(jīng)典毒株CV777與LZC，所有擴(kuò)增的S基因編碼的S蛋白在第55—58氨基酸位點(diǎn)均有4個(gè)氨基酸的插入，在第159—160位氨基酸位點(diǎn)均有2個(gè)氨基酸的缺失。然而，擴(kuò)增的XY4S、ZMD4/5/7/8/9S、NY4/8/10SS基因編碼的S蛋白在第1 362—1 366 氨基酸位點(diǎn)有5個(gè)氨基酸的缺失，XY3/8/9S、XC1S在第161位以及第1 362—1 366 位氨基酸位點(diǎn)有6個(gè)氨基酸的缺失。XY4S、ZMD4/5/7/8/9S、NY4/8/10S、XY3/8/9S與XC1的S蛋白與其他毒株相比在C端有11個(gè)氨基酸的缺失。

PEDV的S蛋白是一個(gè)含有四個(gè)中和表位的一型糖蛋白。四個(gè)中和表位：COE(499—638 aa)、SS2(748—755 aa)、SS6(764—771 aa)與2C10(1 368—1 374 aa)。所有擴(kuò)增的S基因片段的中和表位與代表毒株進(jìn)行分析比對，結(jié)果顯示：氨基酸的替換主要位于COE與2C10兩個(gè)區(qū)域，中和表位SS2與SS6兩個(gè)區(qū)域相對比較保守。在中和表位COE區(qū)域，LY1S有三個(gè)位點(diǎn)的氨基酸突變，分別如下：562位的賴氨酸突變?yōu)樘於彼幔?07位的絲氨酸突變?yōu)楦拾彼幔?08位的甘氨酸突變?yōu)轭R氨酸。NY1S與NY5S有兩個(gè)相同的突變，即：538位的苯丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸，608位的甘氨酸突變?yōu)轭R氨酸。XY2S有四個(gè)突變，即：580位的賴氨酸突變?yōu)榫彼幔?92位的丙氨酸突變?yōu)楦彼幔?07位的絲氨酸突變?yōu)樘於彼幔?08位的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸。XC2、XX1S、LH1S與XY7S毒株有三個(gè)相同的突變，分別如下：520位的組氨酸突變?yōu)榫彼幔?26位的異亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸，583位的賴氨酸突變?yōu)樘於０贰Z1S有兩個(gè)氨基酸突變，即：526位的異亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸，583位的賴氨酸突變?yōu)樘於０?。在中和表?C10區(qū)域，很多擴(kuò)增的S基因編碼的S蛋白在1 371氨基酸位點(diǎn)或1 375氨基酸位點(diǎn)有一個(gè)突變。ZMD4/11S、LY1S、NY1/5S、XY2S與ZMD3S均在1 375氨基酸位點(diǎn)由丙氨酸突變?yōu)轭R氨酸。XY3/4/8/9S、ZMD4/5S、NY4/8/10S、ZMD7/8/9S與XC1S毒株均在1 371氨基酸位點(diǎn)由谷氨酰胺突變?yōu)榱涟彼?。然而，所有擴(kuò)增的S基因編碼的S蛋白在SS2與SS6兩個(gè)中和表位沒有一個(gè)氨基酸突變。

圖1 PEDV S基因的進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of PEDV S gene

3 討 論

3.1 關(guān)于PEDV S基因擴(kuò)增測序

目前，PEDV在中國流行并且很多學(xué)者已經(jīng)報(bào)道PEDV變異毒株正在不斷出現(xiàn)，經(jīng)典毒株制作的PEDV弱毒疫苗可能對于新出現(xiàn)的PEDV變異毒株不具有完全的保護(hù)能力[12-15]。本研究中，2014年至2015年中國中部河南省各地區(qū)豬場腹瀉病料中，擴(kuò)增到38株P(guān)EDV的S全基因片段并測序。將擴(kuò)增的S基因與參考毒株進(jìn)行遺傳演化分析。結(jié)果表明：所有擴(kuò)增的S基因與新分離的變異毒株CH/ZMDZY/11、AH2012、USA Colorado 2013以及2011年后中國和美國分離的毒株親緣關(guān)系很近，均屬于Group2。遺傳演化分析結(jié)果與先前的報(bào)道相似[16-17]，證明現(xiàn)今在河南省境內(nèi)流行的PEDV毒株為變異毒株。

3.2 關(guān)于PEDV S基因進(jìn)化樹分析

另外，Group2又進(jìn)一步被分為五個(gè)亞組，分別為Subgroup1、Subgroup2、Subgroup3，Subgroup4和Subgroup5。擴(kuò)增的ZMD10/11S、PDS1/2S、NY9S、XY5SS基因片段與從中國南部分離出的GD-1、CHGD-01毒株親緣相近，屬于Subgroup2。LY1S、NY1/5S和XY2S屬于Subgroup3，與中國北部、東部、中部分離的變異毒株BJ-2011-1、AH2012、AJ1102親緣關(guān)系相近。進(jìn)一步分析得出，ZMD3/4/5/7/8/9S、XY1/4/6S、NY2/3/4/6/7/10S與LH2S毒株與USA Colorado 2013毒株親緣關(guān)系相近，屬于Subgroup4[18]。其他擴(kuò)增的S基因片段與中國中部分離的CH ZMDZY 11毒株親緣關(guān)系相近，屬于Subgroup5[19]。這些結(jié)果表明，本次從河南省擴(kuò)增的38株P(guān)EDVS基因片段經(jīng)歷了不同的變異演化。

3.3 關(guān)于PEDV S蛋白氨基酸序列比對分析

對于中國PEDV野毒毒株S基因全長進(jìn)行演化分析，將會(huì)有助于更好地了解中國河南省PEDV毒株的遺傳演化關(guān)系。分析結(jié)果表明：所有擴(kuò)增的PEDVS基因片段都有一個(gè)共同的重要特點(diǎn)，即編碼的S蛋白有氨基酸的插入和缺失。擴(kuò)增的38株P(guān)EDVS基因編碼的S蛋白在第55—58位氨基酸位點(diǎn)均有4個(gè)氨基酸的插入，在第159—160位氨基酸位點(diǎn)均有2個(gè)氨基酸的缺失，與之前的研究報(bào)道相似[20]。

3.4 關(guān)于PEDV S蛋白免疫原性分析

PEDV的S蛋白屬于Ⅰ型糖蛋白，包括四個(gè)中和表位，分別為COE(499—638 aa)、SS2(748—755 aa)、SS6(764—771 aa)與2C10(1 368—1 374 aa)。序列比對分析結(jié)果表明，擴(kuò)增的38株P(guān)EDVS基因編碼的S蛋白在中和表位SS2與SS6是保守的，未發(fā)生突變。與經(jīng)典毒株CV777相比，在中和表位COE區(qū)域，XY2S、XC2、XX1S、LH1S、XY7S、LY1S 和JZ1S毒株均有氨基酸突變。在中和表位2C10區(qū)域，擴(kuò)增的38株P(guān)EDVS基因中有20株編碼的S蛋白有1個(gè)氨基酸突變。另外，XC2S、XX1S、LH1S與XY7S四株與美國分離的USA Colorado 2013毒株有相似的氨基酸突變[12]。有7株與BJ-2011-1、USA Colorado 2013、CH/ZMDZY/11相似，第1 375位的丙氨酸突變?yōu)轭R氨酸[7，12，20]。PEDV的S蛋白是一個(gè)位于病毒表面的糖蛋白，并且誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體[6，20]。這些擴(kuò)增的S基因編碼的S蛋白的中和表位氨基酸的突變是否會(huì)影響機(jī)體中和抗體的產(chǎn)生，有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

擴(kuò)增河南地區(qū)2014—2015年采集病料中的38株豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的S基因并測序。分析顯示所有PEDVS基因擴(kuò)增片段與近年來中國和美國分離的變異毒株親緣關(guān)系較近；擴(kuò)增的PEDVS基因編碼蛋白中存在氨基酸的插入和缺失；部分編碼蛋白序列在C端有11個(gè)氨基酸的缺失；許多編碼蛋白序列的中和表位COE和2C10區(qū)域存在氨基酸突變。

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