楊 恒，肖 雷，李占鴻，孟錦昕，楊振興，呂敏娜，林栩慧，廖德芳，牛保生，李華春*

(1. 云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 熱帶亞熱帶動物病毒重點實驗室，昆明650224;2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣州510640；3. 云南省師宗縣動物疫病預(yù)防控制中心，師宗655799)

帕利亞姆血清群病毒(Palyam serogroup virus, PALV)為呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)基因組分節(jié)段雙鏈RNA(dsRNA)蟲媒病毒，廣泛分布于熱帶、亞熱帶與溫帶地區(qū)，可感染多種反芻動物，其中以牛最為易感。病毒主要通過吸血昆蟲庫蠓(Culicoides)對動物的吸血性叮咬傳播[1-2]。PALV具有多種不同的血清型，由于歷史原因，不同血清型的PALV往往以病毒首次分離地的地名進(jìn)行命名，因此容易讓人誤認(rèn)為它們是不同類型的病毒，但實際為同一種病毒的不同血清型。目前報道的PALV血清型有Chuzan virus(CHUV)、D’Aguilar virus(DAV)、Bunyip Creek virus(BCV)、CSIRO Village virus、Petevo virus、Gweru virus、Marondera virus、Marrakai virus、Abadina virus以及Vellore virus[3]。

CHUV于1985年首次從日本中山縣庫蠓C.oxystoma和牛血液中分離獲得，因而命名為中山病毒[4]。CHUV為導(dǎo)致1985—1986年日本暴發(fā)的新生牛積水性無腦小腦發(fā)育不全綜合征(hydranencephaly cerebellar hypoplasia syndrome, HCH)的病原[5]，目前日本已經(jīng)研發(fā)了針對CHUV的滅活疫苗，用于控制本病的流行[6-7]。2007年韓國的一項家畜蟲媒病毒血清學(xué)調(diào)查研究顯示，發(fā)生流產(chǎn)牛的CHUV抗體陽性率為22.8%，認(rèn)為CHUV可能與牛的流產(chǎn)有一定的關(guān)系[8]。DAV與BCV最早分別于1970與1975年從澳大利亞的庫蠓C.oxystoma與C.peregrinus中分離。2016年，日本從監(jiān)控牛群與庫蠓上分離出多株DAV與BCV，證實了兩種病毒在日本的流行[9]。目前關(guān)于BCV與DAV致病性報道較少，推測兩種病毒可能與發(fā)生在牛上的流產(chǎn)有一定關(guān)系，但仍需進(jìn)一步通過動物試驗證明[10]。

與環(huán)狀病毒屬的藍(lán)舌病病毒(BTV)和鹿流行性出血熱病毒(EHDV)類似[11]，PALV的基因組大小約21 kb，由Seg-1(3.9 kb)至Seg-10(0.7 kb)等10個基因節(jié)段構(gòu)成，可編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP7)與三種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1～NS3)[12-14]。Seg-2編碼的VP2蛋白決定著PALV的血清型，誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒的血清型特異性中和抗體，其核酸與氨基酸序列在不同血清型毒株之間高度變異。Seg-7編碼的VP7蛋白為PALV的群特異性抗原，可誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒的群特異性抗體，其氨基酸序列在不同血清型之間高度保守，Seg-7核酸序列在不同地域分離的毒株之間存在著一定差異，體現(xiàn)出病毒的地域特征[15-16]。

2012年，我們從云南省師宗縣的監(jiān)控牛上首次分離出CHUV(SZ/187毒株)，并完成其全基因組序列測定[17]，隨后王芳(F.Wang)等[18]在項目設(shè)立于廣西壯族自治區(qū)馬山市的監(jiān)控牛中也分離出CHUV(GX871毒株)。通過對兩株中國CHUV毒株基因組序列的比較顯示，兩個毒株Seg-1至Seg-10基因節(jié)段的核酸序列相似度均大于99%，表明在我國云南與廣西流行的CHUV有著非常近的親緣關(guān)系。

為掌握PALV在我國大陸地區(qū)的分布、血清型與病毒的遺傳背景，2012—2016年我們在云南、廣東與廣西設(shè)立的監(jiān)控動物牛上開展了PALV的分離工作，相繼分離出19株P(guān)ALV。本文對我國PALV的分離、鑒定、Seg-2與Seg-7的序列特征進(jìn)行了報道，研究結(jié)果將有助于掌握我國PALV的分布、遺傳背景以及與世界范圍PALV毒株之間的關(guān)系，為PALV診斷試劑的開發(fā)、流行病學(xué)調(diào)查與致病性研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

磁珠法病毒RNA抽提試劑盒MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Thermo公司； RNA提取試劑RNAiso-Plus、病毒RNA/DNA抽提試劑盒、高分辨率瓊脂糖、PrimeScritp逆轉(zhuǎn)錄酶、ExTaqDNA聚合酶、膠回收試劑盒、熒光定量qRT-PCR試劑盒，購自大連寶生物公司；氯化鋰(LiCl)購自Sigma公司。

1.2 細(xì)胞株、毒株、抗體

BHK-21細(xì)胞，BTV-1型毒株(Y863)、EHDV-1型毒株(V128/2014)與CHUV毒株(SZ/187)由本實驗室分離保存；兔抗CHUV多克隆抗體由本實驗室制備保存；FITC標(biāo)記羊抗兔IgG熒光二抗，購自武漢博士德公司。

1.3 監(jiān)控點與監(jiān)控動物的設(shè)立

通過對云南、廣西、廣東牛、羊蟲媒病毒的血清學(xué)調(diào)查并結(jié)合當(dāng)?shù)氐臍夂?、地理環(huán)境的分析，作者在我國的云南省師宗縣、廣西壯族自治區(qū)馬山市以及廣東省汕頭市郊區(qū)分別設(shè)定了三個牛、羊蟲媒病毒監(jiān)控點。在監(jiān)控點設(shè)置BTV血清學(xué)陰性的牛和羊作為蟲媒病毒監(jiān)控動物，每年3至10月定期從監(jiān)控動物上采血進(jìn)行蟲媒病毒的檢測與分離工作。

1.4 血液樣品的采集與病毒分離

從監(jiān)控動物上采集的肝素鈉抗凝血、EDTA抗凝血與常規(guī)血液三種血液樣品于4 ℃保存，并送至實驗室進(jìn)行蟲媒病毒的檢測與病毒分離工作。取200 μL EDTA抗凝血3 000 r·min-1離心10 min收集紅細(xì)胞(RBCs)，以PBS洗滌1次，加入1 mL滅菌水作用10 min裂解RBCs。取50 μL RBCs 裂解液以MagMax Express核酸自動提取儀提取核酸，采用本實驗室建立的牛羊蟲媒病毒高通量Real Time qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行血液樣本中BTV、EHDV、PALV、阿卡斑病毒與牛流行熱病毒的核酸檢測。對qRT-PCR檢測為PALV陽性的血液樣本(Ct值>38)，取200 μL RBCs裂解液接種長為單層的BHK細(xì)胞并連續(xù)盲傳5代，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(CPE)時，收獲細(xì)胞上清，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設(shè)計與合成

依據(jù)我們前期獲取的中國CHUV毒株(SZ/187與GX871)序列[17-18]以及GenBank公布的PALV毒株的序列，以PALV的群保守性Seg-7基因節(jié)段和血清型特異性Seg-2基因節(jié)段為靶序列，設(shè)計4對擴(kuò)增引物分別用于PALVSeg-7以及BCV、CHUV和DAV三種血清型Seg-2的特異性RT-PCR擴(kuò)增。引物由上海捷瑞公司合成，引物序列見表1。

表1PALV的Seg-7與BCV、CHUV和DAV的Seg-2RT-PCR擴(kuò)增引物

Table1RT-PCRamplificationprimerstargetingSeg-7ofPALVandSeg-2ofBCV,CHUVandDAV

引物名Primersname引物序列(5'-3')Primerssequence位置Primerslocation產(chǎn)物大小/bpProductssizePALV-S7-FGCCAACTACACAACAAGAAAGSeg-7:171-191791PALV-S7-RCCGAATATAACAGTAAAGCCASeg-7:941-961BCV-S2-FGRGCTRTCATAGATTCGGAAGCSeg-2:987-10081251BCV-S2-RTACAAACYTTTACYAGAGCCATSeg-2:2215-2237CHUV-S2-FGGATTCACGCYATTACTCGGASeg-2:1175-11951004CHUV-S2-RATGGATTTCTTGTTGGGATTATSeg-2:2157-2178DAV-S2-FATTTTTCAACGAAGAGACGTGSeg-2:929-9491223DAV-S2-RATAGGAACACCTTTACCYAGGSeg-2:2131-2151

1.6 核酸提取、RT-PCR擴(kuò)增與測序

采用病毒RNA/DNA抽提試劑盒提取病毒核酸， 94 ℃變性3 min后立即冰浴，進(jìn)行病毒dsRNA的解鏈。以變性后的核酸為模板，使用Radoms 6 mers引物和PrimeScritp逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA的合成。取2 μL合成的cDNA為模板，以ExTaqDNA聚合酶進(jìn)行PALV的Seg-7與Seg-2的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，對擴(kuò)增大小符合預(yù)期條帶進(jìn)行電泳膠回收與測序，使用Gontig Express軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接。將獲取的序列進(jìn)行BLAST比對，對病毒的種屬與血清型進(jìn)行判定。

1.7 高分辨率瓊脂糖凝膠電泳分析

將我國分離的BTV-1(Y863毒株)，EHDV-1(V128/2014毒株)、CHUV(SZ/187毒株)、DAV(V106/YN/2014毒株)與BCV(V104/YN/2014毒株)分別接種單層BHK-21細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)完全CPE后，離心收集細(xì)胞，使用RNAiso-Plus按說明書提取細(xì)胞總RNA。按文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行基因組dsRNA的純化。以高分辨率瓊脂糖配制2%濃度的凝膠，取10 μL純化后的病毒基因組dsRNA于4 ℃以90 V電壓電泳4～5 h，比較分析BTV、EHDV、CHUV、DAV和BCV五種病毒基因組dsRNA的電泳帶型。

1.8 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從GenBank中下載分離自中國、日本、印度、澳大利亞與津巴布韋PALV毒株的Seg-2與Seg-7序列。使用Mega 6.0軟件[20]與本研究中獲取的序列進(jìn)行比對，將比對結(jié)果以軟件中的鄰近法(Neighbor-joining，NJ)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，選擇模型參數(shù)為：P-distanc，自舉檢驗(Bootstrap)取值1 000。

1.9 免疫熒光試驗

將CHUV(SZ/187毒株)、DAV(V106/YN/2014毒株)、BCV(V104/YN/2014毒株)分別接種12孔板BHK-21細(xì)胞，并設(shè)定未接毒空白細(xì)胞作為陰性對照，培養(yǎng)72 h。待細(xì)胞開始出現(xiàn)CPE時，棄去培養(yǎng)液，以預(yù)冷的甲醇/丙酮混合液(1∶1)室溫固定20 min，PBST洗滌細(xì)胞一次；以5%的脫脂奶于37 ℃封閉1 h；棄去封閉液，加入200 μL兔抗CHUV多克隆抗體(1∶200稀釋)37 ℃孵育1 h，以PBST洗滌細(xì)胞三次；加入FITC標(biāo)記羊抗兔IgG熒光二抗200 μL(1∶400稀釋)37 ℃孵育1 h，以PBST洗滌細(xì)胞三次，于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光。

1.10 病毒中和試驗

選擇云南省分離的SZ/187毒株、V106/YN/2014毒株與V104/YN/2014毒株分別作為中國分離PALV的CHUV、DAV與BCV血清型參考毒株，進(jìn)行病毒的噬斑純化。將純化后的三個參考毒分別進(jìn)行10-1至10-7連續(xù)10倍稀釋，每個稀釋度按50 μL·孔-1的量，接種96孔板培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)6 d觀察CPE，采用Reed-Muench法計算病毒的TCID50。將自然感染SZ/187、V106/YN/2014與V104/YN/2014三個毒株動物的血清以56 ℃滅活30 min，并以1∶20～1∶640連續(xù)倍比稀釋備用。取50 μL 100 TCID50的參考毒病毒液，采用“固病毒-稀釋血清”的方法測定感染動物血清的中和抗體效價；采用交叉保護(hù)中和試驗分析CHUV、DAV與BCV陽性血清之間是否存在交叉保護(hù)。

2 結(jié) 果

2.1 中國PALV毒株的分離

2012至2016年作者在我國云南省師宗縣、廣西壯族自治區(qū)馬山市以及廣東省汕頭市送檢的牛、羊血液樣品中，通過PALV的特異性Real Time qRT-PCR共計檢測出47份陽性血液樣品。取PALV核酸陽性血液以BHK-21細(xì)胞進(jìn)行病毒的連續(xù)盲傳分離，在盲傳的第3～5代，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(CPE)，表現(xiàn)為大量的貼壁細(xì)胞變圓與脫落(圖1)。本研究共計分離出19株P(guān)ALV，病毒分離信息見表2。

2.2 中國分離PALV Seg-7與Seg-2的擴(kuò)增與序列分析

對PALV的Seg7序列比對顯示，中國分離的19株P(guān)ALV的Seg-7核酸序列相似性在97.9%～100%，與中國臺灣分離毒株相似性在98.1%～99.1%，與日本分離毒株相似度在96%～97.4%，與印度分離毒株的相似度在93.9%～94.9%，與澳大利亞和津巴布韋分離毒株的相似性最低，在83.8%～90.5%。

對PALV的Seg2序列比對結(jié)果顯示，本研究分離的PALV分屬CHUV、DAV與BCV三種血清型(表2)。云南與廣西分離的13株CHUV的Seg-2核酸序列相似性在99%～100%，與日本分離CHUV毒株序列相似性在96.2%～98.3%。云南分離的3株DAV的Seg-2核酸序列相似性大于99.5%，與日本分離DAV毒株相似性在94.7%～98.4%，與澳大利亞和津巴布韋DAV毒株的相似性為91%。云南與廣東分離的4株BCV的Seg-2與日本分離BCV毒株核酸序列相似性均大于99%，與澳大利亞分離BCV毒株的相似性在91%～92.2%。

A. 感染細(xì)胞；B. 對照細(xì)胞A. Infected cells; B.Control cells圖1 PALV感染BHK-21細(xì)胞引起的CPEFig.1 CPE of BHK-21 cells caused by the infection of PALV

表22012至2016年我國分離PALV的分離信息

Table2IsolationinformationofChinesePALVform2012to2016

毒株號StrainNo.病毒/血清型Virus/serotype分離動物Isolatedanimal分離時間Isolatedtime分離地點IsolatedsiteSZ/187PALV/CHUV13號牛2012年8月云南省師宗縣V144/YN/2012PALV/CHUV14號牛2012年9月云南省師宗縣GX871PALV/CHUV水牛2013年8月廣西壯族自治區(qū)馬山市V104/YN/2014PALV/BCV10號牛2014年10月云南省師宗縣V145/YN/2014BPALV/BCV/CHUV4號牛2014年9月云南省師宗縣V103/YN/2014PALV/CHUV5號牛2014年8月云南省師宗縣V101/YN/2014PALV/CHUV20號牛2014年8月云南省師宗縣V100/YN/2014PALV/CHUV4號羊2014年8月云南省師宗縣V099/YN/2014PALV/CHUV4號羊2014年8月云南省師宗縣V078/YN/2014PALV/CHUV20號牛2014年8月云南省師宗縣V098/YN/2014PALV/CHUV17號牛2014年9月云南省師宗縣V142/YN/2014PALV/CHUV19號牛2014年9月云南省師宗縣V106/YN/2014PALV/DAV4號牛2014年9月云南省師宗縣V141/YN/2014PALV/CHUV4號牛2014年9月云南省師宗縣V156/YN/2015APALV/CHUV水牛2015年8月云南省紅河州V157/YN/2015APALV/DAV水牛2015年8月云南省紅河州V256/GD/V2015PALV/BCV奶牛2015年11月廣東省汕頭市V203/YN/2016PALV/DAV牛2016年8月云南省師宗縣V252/GD/V2016PALV/BCV奶牛2016年1月廣東省汕頭市

A. V156/YN/2015與V157/YN/2015毒株分離自紅河州送檢血液樣品，而非監(jiān)控動物；B. V145/YN/2014同時含有BCV與CHUV兩種血清型病毒

A. The V156/YN/2015 and V157/YN/2015 strains were isolated from blood samples of Red River State, not monitoring animals；B. V145/YN/2014 contains two serotype viruses of BCV and CHUV

2.3 中國分離PALV的dsRNA電泳分析

基因組核酸電泳可用于初步判斷基因組分節(jié)段dsRNA病毒的種類[20]。我們提取并純化了BTV、EHDV、CHUV、BCV、DAV五種病毒的基因組dsRNA，以2%的高分辨率瓊脂糖進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖2顯示，PALV的CHUV、DAV、BCV三種血清病毒dsRNA型電泳帶型完全一致，呈現(xiàn)“3-3-4”的電泳帶型特征，而BTV和EHDV呈現(xiàn)出“3-3-3”的電泳帶型，與PALV基因組電泳帶型有著明顯的差異，這提示PALV的基因組節(jié)段大小與BTV和EHDV存在明顯差異，可通過核酸電泳“帶型”的差異對這三種病毒進(jìn)行快速區(qū)分。

1.BTV; 2.EHDV; 3.BCV; 4.CHUV; 5.DAV圖2 BTV、EHDV、BCV、CHUV、DAV基因組dsRNA高分辨率瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 The high-resolution agarose gel electrophoresis result of genomic dsRNA of BTV, EHDV, BCV, CHUV and DAV

2.4 中國分離PALV Seg-2與Seg-7的系統(tǒng)發(fā)生樹分析

不同血清型PALV的Seg-7顯示出明顯的地域特征(圖3)，可分為四簇：來自中國、日本與印度的不同血清型PALV共同形成一個大簇，我們將其命名為“Asia Group”，來自澳大利亞的PALV可形成兩個獨立的簇，分別命名為“Australia Group 1”與“Australia Group 2”，而來自非洲津巴布韋的PALV形成另一獨立的簇，命名為“Zimbabwe Group”。

不同血清型PLAV分離毒株Seg-2的分子系統(tǒng)發(fā)育分析顯示(圖4)，中國CHUV、DAV、BCV三種血清毒株與日本、澳大利亞分離對應(yīng)血清型毒株聚為一簇。值得注意的是，在同一血清型毒株中，Seg-2的序列也體現(xiàn)出了一定的地域性，日本與中國分離毒株聚為緊密的一簇，而來自澳大利亞的毒株形成一個獨立于中國與日本毒株的分支。

2.5 中國分離BCV、CHUV與DAV毒株的免疫熒光分析

以實驗室制備的兔抗CHUV陽性血清為一抗，對感染了CHUV、BCV與DAV的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色分析。結(jié)果如圖5顯示，制備的CHUV陽性血清可與病毒感染后細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，使BHK細(xì)胞顯現(xiàn)出特異性綠色熒光，而未感染病毒的對照細(xì)胞無熒光。

2.6 中國分離BCV、CHUV與DAV毒株的血清中和試驗

自然感染SZ/187、V106/YN/2014與V104/YN/2014三個毒株的牛血清對100 個TCID50的CHUV、DAV與BCV病毒液的中和抗體效價均在1∶160以上，而1∶20稀釋的對照陰性血清對病毒液未產(chǎn)生中和作用，表明動物發(fā)生了對應(yīng)血清型病毒的感染。交叉中和試驗結(jié)果顯示，CHUV、DAV與BCV三個血清型的中和抗體之間無交叉中和保護(hù)作用。

3 討 論

PALV廣泛分布于熱帶與亞熱帶地區(qū)，非洲的幾內(nèi)亞、尼日尼亞、津巴布韋，大洋洲的澳大利亞，亞洲的中國臺灣地區(qū)、印度、日本、韓國均有該病毒的分離報道[1, 3-4, 8-9 ]。長久以來，PALV在我國大陸地區(qū)的分布情況、與國外毒株之間的關(guān)系以及對動物的危害等問題一直不清楚。近10年來，由于全球氣溫升高等因素，新發(fā)和復(fù)發(fā)蟲媒病毒病不斷出現(xiàn)，對畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[21]。為掌握我國牛、羊蟲媒病毒的分布與流行特征，作者在我國的云南、廣西、廣東、湖北、江蘇、山西、新疆、內(nèi)蒙古等8個省建立了牛、羊蟲媒病毒鑒定點并設(shè)定了監(jiān)控動物。自2012年首次從云南省的監(jiān)控牛上分離出CHUV以來[17]，我們連續(xù)5年在云南、廣西與廣東省的監(jiān)控動物上分離出PALV，表明該病毒很可能廣泛流行于我國南方地區(qū)。

我們從監(jiān)控動物與送檢血液樣品中檢出47份PALV核酸陽性血液樣品，然而將這些陽性血液樣品在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)盲傳卻只分離出19株P(guān)ALV，仍有部分陽性血液未能分離出病毒。我們認(rèn)為可能有兩方面的原因：(1)PALV陽性血液在BHK細(xì)胞上盲傳可能不是PALV最佳的分離方式。我們分離的第一株P(guān)ALV(SZ/187)，通過將血液樣本在BHK-21細(xì)胞連續(xù)盲傳獲得成功分離，因此后繼大部分PALV的分離工作采用該方式進(jìn)行。王芳(F.Wang)等[18]采用C6/36盲傳1代而后繼續(xù)在BHK細(xì)胞連續(xù)盲傳的方式也從牛血液樣品中分離到了PALV毒株，提示PALV可以采用不同的方式進(jìn)行病毒分離，至于哪種分離方式對病毒分離效率最高，我們可以參考BTV的分離方式[22]進(jìn)行比較與摸索，從而提高PALV的分離效率。(2)當(dāng)感染動物產(chǎn)生了感染病毒的中和抗體以后，血液中抗體與病毒的結(jié)合將導(dǎo)致病毒對接種細(xì)胞的感染能力大幅下降[22]。這可能是我們雖然檢測到PALV核酸陽性，但病毒分離失敗的一個原因。通過PALV的動物感染試驗，分析在不同的時間點感染動物血液中病毒核酸的水平、病毒中和抗體水平以及病毒成功進(jìn)行分離之間的關(guān)系，可幫助選擇最佳的時間點對監(jiān)控動物進(jìn)行采血，有效開展PALV的分離工作。

圖中●表示本研究中分離的PALV毒株及其他中國分離株● represents the isolated PALV strains in this study and other Chinese isolates圖3 鄰近法構(gòu)建的PALV Seg-7序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig 3 Phylogenetic analyses available Seg-7 of PALV with Neighbor-joining method

圖中●表示本研究中分離的PALV毒株● represents the isolated PALV strains in this study圖4 鄰近法構(gòu)建的PALV Seg-2系統(tǒng)發(fā)生樹圖Fig 4 Phylogenetic analyses available Seg-2 of PALV with Neighbor-joining method

A. CHUV感染細(xì)胞；B.BCV感染細(xì)胞；C.DAV感染細(xì)胞；D.未感染BHK對照細(xì)胞A. CHUV infected cells; B.BCV infected cells; C.DAV infected cells; D. Uninfected BHK cells圖5 BHK-21細(xì)胞感染BCV、CHUV和DAV 72 h后的免疫熒光觀察結(jié)果Fig 5 Immunofluorescence result of BHK-21 cells after infected respectively with BCV, CHUV and DAV for 72 h

通過對PALV保守的Seg-7節(jié)段的測序與系統(tǒng)發(fā)育分析顯示該基因節(jié)段體現(xiàn)出了明顯的地域性。分離至中國、日本、印度三個國家的PALV聚為一個獨立的“Asia Group”，而分離自澳大利亞與非洲的PALV則形成了各自單獨的進(jìn)化簇。這一方面表明PALVSeg-7節(jié)段的核酸序列可作為不同血清型PALV地域性(Topotype)判定的一個標(biāo)準(zhǔn)[15]，另一方面也提示中國、日本、印度三個國家的PALV有著最近的共有祖先。

對BTVSeg-2的系統(tǒng)發(fā)育分析表明[23-25]：不同血清型的BTV毒株可聚在一起形成一個基因型，并據(jù)此將BTV 27個血清型分為A～L等十二個基因型；在同一個BTV血清型中，還可根據(jù)毒株分離地域的不同進(jìn)一步分為“東方型”和“西方型”以及多個地域亞型。從本研究的結(jié)果來看，我們初步認(rèn)為同一血清型PALV的Seg-2在一定程度上也體現(xiàn)了地域型的差異，但由于世界范圍PLAV序列的缺乏，目前還難以確定PALV的Seg-2是否體現(xiàn)和BTV類似的進(jìn)化特征。隨著更多分離至亞洲、非洲與澳大利亞的不同血清型PALV毒株Seg-2的測序，將有助于我們從整體上進(jìn)一步認(rèn)知該病毒Seg-2與血清型之間的關(guān)系以及進(jìn)化特征。

PALVSeg-2與Seg-6編碼的VP2與VP5蛋白共同決定著病毒的血清型，激發(fā)感染動物產(chǎn)生血清型特異性抗體，Seg-7編碼的VP7蛋白為PALV的群特異性抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生血清群特異性抗體[3,11-13]。我們以制備的CHUV多克隆抗體對感染CHUV、BCV與DAV的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，雖然感染細(xì)胞都可產(chǎn)生特異性熒光，但CHUV的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于BCV與DAV。我們分析CHUV的陽性血清中既含有針對VP7的群特異性抗體，也含有針對CHUV VP2與VP5的特異性抗體，因此免疫熒光試驗結(jié)果顯示出CHUV感染細(xì)胞的免疫熒光信號強(qiáng)，而對BCV與DAV感染細(xì)胞的熒光信號相對較弱。血清中和試驗顯示CHUV、DAV與BCV陽性血清之間無交叉中和活性進(jìn)一步證實了這一點。試驗結(jié)果提示獲取PALV VP7蛋白的單克隆抗體是研究PALV群特異性血清/抗原診斷檢測方法的首選[26]。

本研究報道了2012—2016年中國PALV的分離與Seg-2、Seg-7序列特征，并首次報道了PALV的DAV與BCV兩種血清型病毒在我國的分離。研究結(jié)果為我們進(jìn)一步開展中國PALV的遺傳學(xué)特征、感染與致病性、診斷方法的研究提供了材料。在下一步的研究中，我們將進(jìn)行三方面的工作：(1)對中國分離的PALV代表毒株進(jìn)行全基因組測序，獲取中國分離CHUV、BCV與DAV代表毒株的遺傳背景，分析病毒的變異特點以及毒株之間的基因重配[16]。(2)純化出PALV病毒，建立PALV的血清學(xué)診斷方法，開展血清學(xué)調(diào)查。(3)開展不同血清型PALV毒株對牛羊等動物的感染特性與致病性分析，特別是研究動物發(fā)生多種血清型PALV感染或者與BTV混合感染時病毒的感染特性與致病性特點。

4 討 論

2012—2016年在云南、廣西、廣東監(jiān)控動物牛、羊血液中共計分離出19株 PALV，表明PALV流行于我國南方地區(qū)。對分離株的Seg-2序列分析與BHK-21細(xì)胞上的交叉中和試驗結(jié)果顯示，分離毒株分屬Chuzan virus(CHUV)、D’Aguilar virus(DAV)與Bunyip Creek virus(BCV)三種血清型，分別分離到13、3和4株，PALV三種不同血清型的抗體之間無交叉保護(hù)作用。對Seg-7序列分析顯示，該基因節(jié)段在不同血清型毒株間高度保守，基因序列的變異體出現(xiàn)明顯的地域特征。首次報道了DAV與BCV兩種血清型病毒在中國的分離。

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