胡 靜， 龍燕瓊， 岳 陽， 劉作良

(中南大學湘雅三醫(yī)院， 湖南 長沙 410013)

膿毒癥(sepsis)是指由感染或有高度可疑感染灶引起的全身炎癥反應綜合征。已有研究表明，在膿毒癥的病理生理改變中，血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cells，VECs)會受到損傷，是膿毒癥炎癥反應的靶細胞；損傷的VECs釋放多種炎性因子，加重膿毒癥的進展，故VECs又是效應細胞[1-2]。兒茶酚胺類藥物去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)是改善膿毒癥患者血流動力學紊亂的常用藥物。本研究擬構(gòu)建內(nèi)皮細胞膿毒癥損傷模型，初步探討NE對內(nèi)皮細胞的保護作用及其具體機制。

材 料 和 方 法

1 藥品和試劑

NE和二甲基亞砜(Sigma)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；小牛血清(杭州四季青)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR試劑盒(TaKaRa)；TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-10 ELISA試劑盒(武漢博士德)；BCA蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天)；山羊抗血管內(nèi)皮型鈣黏素(VE-cadherin)抗體(Millipore)；HRP標記的兔抗山羊 II 抗(MBI)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 解凍復蘇人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC-12后加入含10%胎牛血清的DMEM養(yǎng)液制成細胞懸液，分種于培養(yǎng)瓶中，再靜置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃)。每隔2 d換培養(yǎng)液1次，待細胞亞融合時0.25%胰蛋白酶消化傳代。取4～6代呈亞融合的細胞鋪種于6孔板或者12孔板，待細胞80%融合時進行不同的處理。

2.2MTT法檢測細胞活力 用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基將剛消化離心的內(nèi)皮細胞重懸，以1×108/L的密度接種于96孔板，每孔200 μL，96孔板四周加200 μL PBS封孔。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，貼壁后棄細胞上清，加入新鮮的含1%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，同步化細胞。12 h后，實驗分為4組，空白對照(control)組加入100 μL不含LPS的培養(yǎng)液，其余3組為實驗組，分別加入LPS終濃度為50 mg/L和100 mg/L、200 mg/L 的培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)12 h、24 h和48 h時分別取出96孔板，避光，每孔加入10 μL的MTT工作液(5 g/L)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。吸走孔內(nèi)的培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 200 μL，置搖床上振蕩15 min至藍紫色結(jié)晶完全溶解，酶標儀上測定490 nm波長各孔吸光度(A)。細胞抑制率(%)=(空白組A值-實驗組A值)/空白組A值×100%。

2.3細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-10含量的測定 消收集細胞培養(yǎng)板中的上清液后按照試劑盒說明書測定TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-10的含量。

2.4細胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的測定 將細胞以1×108/L的密度接種于96孔板中, 藥物處理后, PBS沖洗細胞3遍, 加入含有10 μmol/L DCFH-DA 的培養(yǎng)液，37 ℃ 細胞培養(yǎng)箱中避光孵育20 min, 用無血清培養(yǎng)液沖洗細胞3次, 然后用熒光分光光度計測定熒光強度，其激發(fā)波長為488 nm, 發(fā)射波長為525 nm。

2.5Real-time PCR 應用Prime Premier 5.0軟件設計目的基因和內(nèi)參照基因引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。VE-cadherin的正向引物序列為5’-ACAGACCGCCGTCTAACTCAAA-3’，逆向引物序列為5’-AGATAGGCACCAGGACCTCACC-3’；GAPDH(內(nèi)參照)的正向引物序列為5’-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3’，逆向引物序列為5’-AGGTCCACCACTGACACGTT-3’。PCR 反應參數(shù)為:預變性95 ℃ 10 s； 95 ℃變性5 s、60 ℃退火和延伸31 s，共40個循環(huán)，在延伸的過程中搜集熒光信號。于每次擴增的同時設置無 cDNA的陰性對照，將 PCR產(chǎn)物做熔解曲線，以證實以上 PCR 反應產(chǎn)物特異性良好。用7300 System SDS Software 分析數(shù)據(jù)，計算2-ΔΔCt值以比較各組mRNA的表達。

2.6Western blot檢測蛋白水平 將指數(shù)生長期的內(nèi)皮細胞分為正常對照(control)組、100 mg/L LPS組(LPS組)及LPS損傷與NE低、中、高劑量共同作用(LPS+50 mg/L NE、LPS+100 mg/L NE和LPS+200 mg/L NE)組，各處理組與人臍靜脈內(nèi)皮細胞株共同孵育24 h后收集細胞，用PBS重懸，提取蛋白。蛋白樣品定量后與上樣緩沖液混合均勻，95 ℃ 5 min變性，自然冷卻后上樣于凝膠加樣孔內(nèi)，上樣量為20 μg，60 V集成、120 V恒壓電泳。轉(zhuǎn)膜48 min后，用5%牛奶封閉1 h后加適量稀釋的 I 抗，4℃孵育16 h，洗膜后加適量稀釋的相應 II 抗，室溫搖床反應 1 h，洗膜后按照 ECL 發(fā)光試劑盒說明書進行顯色。

3 統(tǒng)計檢驗方法

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組均數(shù)比較選擇單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls (SNK)檢驗。使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 LPS誘導內(nèi)皮細胞損傷模型的建立

MTT實驗結(jié)果顯示，細胞抑制率隨著LPS濃度的升高和作用時間的延長而顯著增加，當LPS濃度達到100 mg/L，作用細胞24 h后，其細胞抑制率達50%左右，選定為后續(xù)實驗條件，見圖1。

Figure 1. The effects of different concentrations of LPS for diffe-rent time on the viability of the endothelial cells. Mean±SD.n=6*P<0.05vs12 h；#P<0.05vs24 h；△P<0.05vs50 mg/L；▲P<0.05vs100 mg/L.

圖1各組細胞MTT實驗結(jié)果

2 不同濃度NE對LPS損傷內(nèi)皮細胞釋放炎性因子的影響

檢測細胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-10的濃度，結(jié)果示，與對照組相比，LPS組TNF-α、IL-1β和IL-2水平明顯上升, IL-10的濃度明顯下降(P<0.05)；與LPS組相比，不同濃度的NE可逆轉(zhuǎn)TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-10的含量變化，見表1。

表1 不同濃度NE對LPS損傷內(nèi)皮細胞釋放炎性因子的影響

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

3 不同濃度NE對內(nèi)皮細胞中LPS誘導的ROS水平上調(diào)的影響

內(nèi)皮細胞經(jīng)100 mg/L LPS處理24 h后，與對照組相比，LPS組細胞的ROS水平上升(P<0.05)；當使用低、中、高濃度的NE預處理細胞后，與模型組相比，細胞內(nèi)ROS水平均顯著下降(P<0.05或P<0.01)，見圖2。這表明NE對LPS引起的細胞內(nèi)ROS生成增多有明顯的抑制作用。

Figure 2. The effects of NE on ROS production induced by LPS. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

圖2不同濃度NE對LPS誘導的內(nèi)皮細胞ROS水平的影響

4 不同濃度NE對內(nèi)皮細胞中LPS誘導的VE-cadherin mRNA下調(diào)的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，100 mg/L LPS使內(nèi)皮細胞中VE-cadherin mRNA的表達明顯下調(diào)(P<0.01)，不同濃度(50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L)NE可恢復VE-cadherin mRNA的表達水平，見圖3。

5 不同濃度NE對LPS刺激內(nèi)皮細胞VE-cadherin蛋白表達的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，100mg/L LPS處理細胞后，細胞中VE-cadherin的蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.05)；與LPS組相比，不同濃度NE預處理細胞后，VE-cadherin的蛋白表達明顯上升，見圖4。

Figure 3. The effects of NE on the mRNA expression of VE-cadherin induced by LPS. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsLPS group.

圖3不同濃度NE對LPS誘導內(nèi)皮細胞VE-cadherinmRNA表達的影響

討 論

血管內(nèi)皮在維持心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮極其重要的作用，在生理情況下，只有極小部分(<0.1%)內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡，膿毒癥病人血液中的凋亡內(nèi)皮細胞數(shù)量明顯增多，并且與病人的預后呈線性關系[3]。膿毒癥中大量炎性介質(zhì)如TNF-α、IL-1β和IL-2釋放入血可以誘導內(nèi)皮細胞凋亡[4];內(nèi)皮細胞凋亡、脫落導致血管屏障功能受損并進一步釋放促炎因子；血管通透性升高和防御功能減弱導致組織水腫，病原菌侵入組織，加重膿毒癥的發(fā)展，進而引起有效循環(huán)血量不足和器官組織功能損害。

Figure 4. The effects of NE on VE-cadherin protein expression in the endothelial cells injured by LPS. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

圖4不同濃度NE對LPS誘導內(nèi)皮細胞VE-cadherin蛋白表達的影響

VE-cadherin是內(nèi)皮細胞中的特異性蛋白,位于內(nèi)皮細胞間連接處,是內(nèi)皮細胞黏附連接的主要組成部分,屬于II型鈣黏蛋白[5]。膿毒癥時大量的炎性細胞和炎性介質(zhì)通過已知的、未知的信號途徑導致黏附連接的局部分解、黏附連接復合體的解體、胞漿內(nèi)肌動蛋白微絲系統(tǒng)重組，從而引起內(nèi)皮細胞黏附連接受損，內(nèi)皮細胞間通透性增加?？赡艿臋C制主要包括膿毒癥時活化的中性粒細胞以及其它細胞可以釋放多種酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶，直接使血管內(nèi)皮細胞表面的VE-cadherin分解，細胞間的黏附結(jié)構(gòu)被破壞，引起通透性增加。Herwig等[6]研究顯示，在膿毒癥所致的急性呼吸窘迫綜合征中，VE-cadherin的表達減少是導致血管通透性增加的一項重要機制。

本文研究結(jié)果提示，LPS所致內(nèi)皮細胞損傷使細胞處于明顯的氧化應激損傷狀態(tài)，VE-cadherin的 mRNA及蛋白表達均明顯抑制，TNF-α、IL-1β和IL-2水平明顯上升, IL-10的濃度明顯下降；不同濃度的NE處理能抑制LPS所致VE-cadherin的下調(diào)，并抑制炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-2的水平，改善內(nèi)皮細胞的氧化應激狀態(tài)。根據(jù)實驗結(jié)果，我們認為LPS通過刺激內(nèi)皮細胞釋放促炎因子而抑制VE-cadherin的水平，其機制可能是LPS誘導了內(nèi)皮細胞微環(huán)境中TNF-α、IL-1β和IL-2的表達，從而激活包括NF-κB在內(nèi)的一系列下游信號通路，進一步導致促炎因子的上調(diào)，另一方面LPS損傷內(nèi)皮細胞后還可以誘導氧化應激和活性氧簇的生成，從而對內(nèi)皮細胞的功能造成損傷。NE能夠明顯逆轉(zhuǎn)感染性患者外周血管擴張，改善胃腸道血液灌注，對腸道黏膜屏障具有保護作用[7]，我們的研究結(jié)果表明NE的內(nèi)皮保護作用可能是通過上調(diào)內(nèi)皮損傷中VE-cadherin的表達及對氧化應激水平的抑制而發(fā)揮。本實驗雖然對NE的內(nèi)皮保護作用及其機制做了初步探討，但仍需要大量的體內(nèi)外實驗進一步驗證NE發(fā)揮作用的具體分子機制。

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