周 穎， 趙 敏， 李 桃， 張 輝， 肖 芳

(秦皇島市第一醫(yī)院病理科，河北 秦皇島 066000)

脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)是內(nèi)源性甾體類前體激素，血漿DHEA水平隨年齡增長而降低。近年來大量研究顯示[1-2]，DHEA可以抑制動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的形成和發(fā)展，然而其作用機制尚未明確。維甲酸受體被激活后可增強DHEA轉(zhuǎn)化為雌激素的關(guān)鍵酶——細胞色素P450芳香酶的表達，由此推想，補充全反式維甲酸(all-transretinoic acid, ATRA)可以特異性地增強DHEA的抗AS作用。細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是一種細胞表面的黏附分子，能促進免疫細胞浸潤，使單核細胞和淋巴細胞黏附于內(nèi)皮，然后遷移入內(nèi)皮下，單核細胞分化為巨噬細胞，形成泡沫細胞進而促進AS的發(fā)生發(fā)展[3]。本實驗從體外、體內(nèi)2個水平研究DHEA對高脂誘導(dǎo)的ICAM-1表達的影響，以及全反式維甲酸在這一過程中的作用，從而探討DHEA抗AS的可能機制。

材 料 和 方 法

1 材料

FBS和M199培養(yǎng)基購自Gibco；氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)由中山醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)系提供；DHEA購自Fluka；引物和Trizol購自Invitrogen；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和Oligo(dT)購自TOYOBO；全反式維甲酸購自山東良福集團制藥有限公司；內(nèi)皮細胞生長添加劑購自Sigma；Taq酶和dNTP購自天為時代公司；GoldView核酸染料購自賽百盛公司；ELISA試劑盒購自R&D；抗 ICAM-1抗體及通用型SP試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

2 方法

2.1人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical venous endothelial cells，HUVECs)的原代培養(yǎng)與分組 用胰酶消化法獲取HUVECs。采用內(nèi)含15% FBS、0.03%谷氨酰胺和50 mg/L 內(nèi)皮細胞生長添加劑的M199培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。每3～4 d傳代1次，將1～3代的細胞用于實驗。將生長良好的細胞換用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后，分為5組：(1)正常對照(control)組：DMEM/F12培養(yǎng)基；(2) ox-LDL組：DMEM/F12培養(yǎng)基+25 mg/L ox-LDL；(3) ox-LDL+DHEA組：DMEM/F12培養(yǎng)基+25 mg/L ox-LDL+1 μmol/L DHEA；(4) ox-LDL+DHEA+ATRA組：DMEM/F12培養(yǎng)基+25 mg/L ox-LDL+1 μmol/L DHEA+10-8mol/L全反式維甲酸；(5) DHEA組：DMEM/F12培養(yǎng)基+1 μmol/L DHEA。以上各組均用相應(yīng)藥物作用24 h。

2.2RT-PCR反應(yīng) 用Trizol一步法提取各組HUVECs的總RNA，每組取4 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取2 μL cDNA產(chǎn)物進行RT-PCR反應(yīng)。ICAM-1的上游引物序列為5’-CAGTGACCATCTACAGCTTTCCGG-3’，下游引物序列為5’-GCTGCTACCACAGTGATGATGACAA-3’，擴增產(chǎn)物長450 bp；內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為5’-GCTGGGGCTCACCTGAAGGG-3’ ，下游引物序列為5’-GGATGACCTTGCCCACAGCC-3’ ，擴增產(chǎn)物長度384 bp。PCR反應(yīng)體系為每20 μL反應(yīng)體系中包含 10×buffer 2.0 μL、0.2 mmol/μL引物各0.4 μL、Taq酶0.2μL、Mg2+1.2 μL、dNTPs 0.4 μL和cDNA模板2 μL，其余用無菌三蒸水補足。擴增條件為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min、62 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，35 個循環(huán);72 ℃ 10 min。 取4 μL 擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，繼用SQ9636 型掃描系統(tǒng)掃描。HPIAS-1000 型圖像分析系統(tǒng)檢測各組目的基因及內(nèi)參照的積分吸光度(A) 值，并以兩者比值作為各組mRNA的相對表達量。

2.3細胞酶聯(lián)免疫吸附實驗 以每孔1×105個的細胞密度將HUVECs接種于96孔板，以無血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，按2.1所述分組加藥(每組8孔)，作用24 h。棄去培養(yǎng)液，其中每組取3孔細胞用1mol/L NaOH裂解，用Lowry法進行蛋白定量，其余5孔用4%多聚甲醛固定，正常血清封閉，加羊抗人ICAM-1多克隆抗體(1∶400)，4 ℃孵育48 h，用兔抗羊SP試劑盒檢測ICAM-1蛋白表達。用酶標(biāo)儀在490 nm下檢測各孔細胞的A值。用各孔A值/各孔細胞蛋白總含量的比值表示各孔細胞ICAM-1蛋白的相對表達量。

2.4動物模型的制備 25只正常成年雄性新西蘭大耳白兔，體重2.0～2.5 kg。隨機分為5組，每組5只，分籠喂養(yǎng)，各組分別給予以下飲食喂養(yǎng)10周：(1)正常對照(control)組：正常飼料; (2)高脂(high lipid)組：高脂飼料(含1%膽固醇和3%豬油的飼料); (3)高脂+DHEA組：加入DHEA (0.125 g·kg-1·d-1)的高脂飼料; (4)高脂+DHEA+ATRA組：加入DHEA(0.125 g·kg-1·d-1)和全反式維甲酸(0.6 mg·kg-1·d-1)的高脂飼料; (5)DHEA組：加入DHEA(0.125 g·kg-1·d-1)的正常飼料。

各組大耳白兔喂養(yǎng)10周后禁食12 h，用3%戊巴比妥鈉(1.3 mL/kg)耳緣靜脈麻醉。固定后，迅速打開胸腔心臟采血。之后分離由主動脈弓至腎動脈分支的主動脈，將外膜結(jié)締組織及脂肪組織剝離干凈，沿分支最多處剪開，肉眼觀察，見主動脈弓處斑塊最明顯。從主動脈弓處取一小塊血管，放入-80 ℃冰箱，留做RT-PCR之用。將剩下的血管放入4%多聚甲醛中固定。

2.5血脂的生化檢測 將所采血液分離血清，用全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、總甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)的含量。

2.6免疫組織化學(xué)實驗 將固定好的主動脈石蠟包埋、切片，免疫組織化學(xué)SP法染色，染色步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。采用HPIAS-1000高清晰度圖像處理系統(tǒng)，分析各組切片的免疫組織化學(xué)結(jié)果，用細胞胞漿內(nèi)和胞膜上棕黃色陽性顆粒的平均A值表示其ICAM-1的蛋白表達量。

2.7RT-PCR反應(yīng) 用Trizol一步法提取各組主動脈的總RNA，每組取4 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA。取1 μL cDNA產(chǎn)物進行RT-PCR反應(yīng)。ICAM-1的上游引物序列為5’-GAGCTGTTTGAGAACACCTC-3’，下游引物序列為5’-TCACACTTCACTGTCACCTC-3’，擴增產(chǎn)物長407 bp；內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為5’-GCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTT-3’，下游引物序列為5’-TGCCGAAGTGGTCGTGGATGACCT-3’，擴增產(chǎn)物長465 bp。PCR反應(yīng)體系除cDNA模板為1 μL外，其余同2.2。擴增條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min、63 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，30個循環(huán);72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳和半定量分析同2.2。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件處理，主要統(tǒng)計指標(biāo)進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布的各個統(tǒng)計指標(biāo)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間統(tǒng)計學(xué)差異顯著性采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細胞實驗

RT-PCR及ELISA結(jié)果顯示，ox-LDL組ICAM-1的mRNA和蛋白表達明顯高于正常對照組(P<0.05)；ox-LDL+DHEA組ICAM-1的mRNA和蛋白表達與ox-LDL組相比明顯降低(P<0.05)；ox-LDL+DHEA+ATRA組與ox-LDL+DHEA組ICAM-1 mRNA和蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；DHEA組與正常對照組ICAM-1 mRNA和蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見圖1、表1。

Figure 1. ICAM-1 mRNA in HUVECs of all groups detected by RT-PCR.

圖1各組HUVECsICAM-1的mRNA表達情況

表1各組HUVECsICAM-1mRNA和蛋白的表達

Table 1. The expression of ICAM-1 at mRNA and protein levels in HUVECs of all groups (Mean±SD.n=5)

GroupAICAM?1/AGAPDHAICAM?1/totalproteinControl0．4044±0．02100．2537±0．0158ox?LDL1．2253±0．0289?0．5553±0．0233?ox?LDL+DHEA0．5558±0．0254#0．3538±0．0131#ox?LDL+DHEA+ATRA0．5344±0．0151#0．3367±0．0138#DHEA0．3814±0．01670．2432±0．0161

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsox-LDL group.

2 動物實驗

2.1血脂的生化檢測 各組TC、 TG、HDL-C和LDL-C的含量見表2，其中TC和LDL-C的含量高脂組高于正常對照組(P<0.05)；高脂+DHEA組與高脂組的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)；高脂+DHEA+ATRA組低于高脂組(P<0.05)；高脂+DHEA+ATRA組低于高脂+DHEA組(P<0.05)；DHEA組與正常對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)。而TG和HDL-C的含量各組間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)。

表2 各組新西蘭大耳白兔血脂水平

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vshigh lipid group；△P<0.05vshigh lipid+DHEA group.

2.2兔主動脈ICAM-1蛋白的表達 免疫組化結(jié)果示,陽性信號為細胞胞漿內(nèi)和胞膜上棕黃色顆粒。與正常對照組相比，高脂組的ICAM-1蛋白表達明顯增強(P<0.05)，表現(xiàn)為棕黃色顆粒明顯增多，顏色明顯加深；同高脂組比較，高脂+DHEA組ICAM-1蛋白表達受到抑制(P<0.05)，表現(xiàn)為顆粒減少、顏色變淺；高脂+DHEA+ATRA組與高脂+DHEA組相比ICAM-1蛋白量的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)；DHEA組與正常對照組相比ICAM-1蛋白量的差異也無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖2、表3。

Figure 2. The protein expression of ICAM-1 in aorta of all groups detected by immunohistochemistry (×200). A: control group; B: high lipid group: C: high lipid+DHEA group; D: high lipid+DHEA+ATRA group; E: DHEA group.

圖2免疫組織化學(xué)法檢測各組主動脈ICAM-1蛋白的表達情況

2.3兔主動脈ICAM-1 mRNA表達 RT-PCR結(jié)果示，高脂組ICAM-1的mRNA表達明顯高于正常對照組(P<0.05)；高脂+DHEA組ICAM-1的mRNA表達與高脂組比較顯著降低(P<0.05)；高脂+DHEA+ATRA組與高脂+DHEA組ICAM-1 mRNA表達的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)；DHEA組與正常對照組ICAM-1 mRNA表達的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖3、表3。

討 論

動脈粥樣硬化是以動脈內(nèi)脂質(zhì)沉積，粥樣斑塊形成及伴隨的炎癥反應(yīng)為病理特征的一種常見病、多發(fā)病。AS的發(fā)生是多因素綜合作用的結(jié)果，涉及損傷的內(nèi)皮細胞與單核巨噬細胞、平滑肌細胞之間的相互作用，以及局部產(chǎn)生的大量細胞因子、生長因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。高脂血癥是AS發(fā)生的獨立危險因子；ox-LDL對血液單核細胞具有趨化作用，并與單核巨噬細胞相互作用使其形成泡沫細胞，在AS的病變形成中起重要作用。ICAM-1是AS發(fā)生發(fā)展進程中的主要因子，在介導(dǎo)單核細胞和內(nèi)皮細胞黏附過程中起著重要作用，單核細胞只有在ICAM-1等作用下才能牢固的黏附在內(nèi)皮細胞上[4]。ICAM-1 在正常血管內(nèi)皮細胞上呈低水平表達，而在AS病變的內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞上表達增加，其中脂紋和斑塊上表達量最大[5]，因此ICAM-1的過表達被認(rèn)為是斑塊早期形成的標(biāo)志和斑塊進展的潛在機制。

Figure 3. ICAM-1 mRNA in aorta of all groups detected by RT-PCR.

圖3各組主動脈ICAM-1的mRNA表達情況

表3各組兔主動脈ICAM-1的mRNA和蛋白的表達

Table 3. The expression of ICAM-1 at mRNA and protein levels in the aorta of all groups (Mean±SD.n=5)

GroupAICAM?1/AGAPDHAICAM?1Control0．1543±0．01840．1032±0．0106Highlipid0．6556±0．0322?0．2533±0．0176?Highlipid+DHEA0．3053±0．0199#0．1827±0．0188#Highlipid+DHEA+ATRA0．2828±0．02200．1621±0．0184DHEA0．1329±0．01960．0931±0．0084

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vshigh lipid group.

DHEA是主要由腎上腺皮質(zhì)細胞合成的一種弱雄激素，是血清中含量最多的一類類固醇激素[6]，其在血漿中的濃度在青春期達高峰，而后隨年齡的增加而迅速遞減，因此它被稱為“青春激素”[7-8]?；贒HEA水平隨年齡的增加而遞減的特點，人們開始關(guān)注DHEA與老年性疾病AS的關(guān)系。流行病學(xué)調(diào)查表明，血漿DHEA水平與AS發(fā)病率呈顯著的負(fù)相關(guān)[9]。Bednarek等[10]的研究結(jié)果表明，DHEA可以減少高膽固醇喂飼兔的動脈壁脂紋面積，且這種作用并不依賴于血脂水平的改變。

本實驗從體外、體內(nèi)2個水平進行研究。體外細胞實驗以ox-LDL作為刺激因素造成體外AS模型。結(jié)果顯示，ox-LDL+DHEA組ICAM-1 mRNA和蛋白的表達與ox-LDL組相比均明顯降低，而DHEA組與正常對照組ICAM-1 mRNA和蛋白的表達無統(tǒng)計學(xué)差異，提示DHEA能特異性地抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs的 ICAM-1表達。動物實驗中，高脂組兔血脂(TC和LDL-C)水平顯著升高，動脈內(nèi)膜有明顯脂紋形成，證明AS模型構(gòu)建成功。高脂+DHEA組與高脂組相比血脂水平無顯著差異，DHEA組與正常對照組相比血脂水平也無顯著差異，說明DHEA對血脂水平的影響不大，DHEA的抗AS作用不依賴于血脂水平的改變。高脂+DHEA組ICAM-1的mRNA和蛋白表達與高脂組比較顯著降低,單DHEA組與正常對照組ICAM-1的mRNA和蛋白表達的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，提示DHEA能特異性地抑制高脂誘導(dǎo)的兔主動脈ICAM-1的表達，且DHEA的這種作用不依賴于血脂水平的改變。這與細胞實驗結(jié)果相一致，由此我們認(rèn)為，DHEA通過抑制高脂誘導(dǎo)的ICAM-1的表達而發(fā)揮抗AS作用。

DHEA在體內(nèi)主要是在細胞內(nèi)細胞色素P450芳香酶的作用下降解成雌酮而發(fā)揮作用[11-12]。增加細胞內(nèi)細胞色素P450芳香酶的活性，應(yīng)該可以特異性地加強DHEA在血管局部發(fā)揮的抗AS作用。研究表明[13]，細胞色素P450芳香酶具有多個啟動子，在血管內(nèi)皮細胞中主要由啟動子Ⅰ.6發(fā)揮作用，維甲酸受體被激活后可通過Ⅰ.6啟動子增強細胞色素P450芳香酶的表達。由此推想，補充全反式維甲酸就可以增強參與AS的細胞內(nèi)雌激素水平，從而特異性的增強DHEA的抗AS作用。然而本研究細胞實驗顯示，ox-LDL+DHEA+ATRA組與ox-LDL+DHEA組ICAM-1 mRNA和蛋白的表達無統(tǒng)計學(xué)差異;動物實驗顯示，高脂+DHEA+ATRA組與高脂+DHEA組ICAM-1 mRNA和蛋白的表達也無統(tǒng)計學(xué)差異。以上結(jié)果均提示，全反式維甲酸對DHEA的上述作用(DHEA抑制高脂誘導(dǎo)的ICAM-1的表達)并無明顯增強作用。推測DHEA的上述作用可能不是通過轉(zhuǎn)化為雌酮而發(fā)揮的，可能是通過直接與涉及ERK1信號通路的特異性受體相結(jié)合而引發(fā)的[14]。這與Simoncini等[15]的報道一致，但其具體分子機制有待進一步深入研究。

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