雷 娜， 張學(xué)平， 王 創(chuàng)

(杭州市第七人民醫(yī)院精神科， 浙江 杭州 310013)

抑郁癥(depression)是一種常見慢性神經(jīng)性疾病，臨床常表現(xiàn)有情緒低落、行為缺乏主動(dòng)和思維遲緩等癥狀。若長期得不到治療或改善，將影響患者的生命以及增加家庭負(fù)擔(dān)[1]。內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，致使皮質(zhì)醇水平上升，引起神經(jīng)細(xì)胞損傷，是抑郁癥患者的一個(gè)重要病理特征[2-3]。因此，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受損傷是抑郁癥治療的一個(gè)重要方向。

隨著神經(jīng)生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控一些神經(jīng)保護(hù)相關(guān)基因可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受損傷[4-5]。既往研究表明，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)表達(dá)減少與抑郁癥發(fā)生有關(guān)[6]。接受抗抑郁癥治療可以增加BDNF表達(dá)，所以調(diào)控BDNF表達(dá)可以成為抗抑郁癥的潛在治療靶點(diǎn)[7-8]。BDNF是一個(gè)受多種微小RNA(microRNA, miRNA, miR)調(diào)控的分子。Sun等[9]發(fā)現(xiàn)miR-206過表達(dá)通過靶向BDNF減輕了大黃素的神經(jīng)疼痛; Li等[11]發(fā)現(xiàn)miR-613可以通過調(diào)節(jié)小鼠海馬區(qū)BDNF表達(dá)參與阿爾茨海默病的發(fā)生過程。已有研究表明，miR-381-3p是一個(gè)抑癌分子，其過表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖[11]，而且miR-381-3p還可以調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化過程[12]，提示miR-381-3p在調(diào)控細(xì)胞生長中的關(guān)鍵作用。但miR-381-3p是否參與抑郁癥發(fā)生過程，以及是否可以通過調(diào)控抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元(hippocampal neurons)中BDNF表達(dá)保護(hù)神經(jīng)元免受損傷尚未可知。因此本研究通過建立大鼠皮質(zhì)酮(corticoste-rone，CORT)抑郁癥模型，觀察miR-381-3p和BDNF在氟西汀(fluoxetine)治療抑郁癥過程的表達(dá)變化,并進(jìn)一步通過建立miR-381-3p沉默的新生大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞株，觀察沉默miR-381-3p對(duì)海馬神經(jīng)元活力及BNDF表達(dá)的影響。

材 料 和 方 法

1 主要材料及試劑

成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，體重160～200 g，購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心；CORT、氟西汀和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma, CORT和氟西汀分別溶于0.1% DMSO，皮下注射時(shí)用0.1% Tween-80生理鹽水稀釋, CORT用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，用DMEM培養(yǎng)基(上海百賽生物技術(shù)有限公司)稀釋；抗BDNF、Bcl-2和Bax抗體購自Abcam；PC12細(xì)胞來源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤克隆的細(xì)胞株，從結(jié)構(gòu)和功能上類似于神經(jīng)元，是研究神經(jīng)元較為理想的細(xì)胞模型，購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫；HEK293T細(xì)胞購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫；去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)ELISA試劑盒購自R&D; miR-381-3p inhibitor購自上海吉瑪公司。

2 方法

2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組 35只SD大鼠隨機(jī)分成4組：對(duì)照(control，n=10)組、造模(model，n=10)組、治療(treatment，n=10)組和氟西汀(fluoxetine，n=5)組。造模組以CORT按40 mg/kg劑量對(duì)大鼠進(jìn)行皮下注射，持續(xù)24 d;治療組大鼠前12 d按40 mg/kg劑量皮下注射CORT，后12 d在皮下注射CORT前按5 mg/kg劑量腹腔注射氟西汀;氟西汀組大鼠前12 d注射等體積生理鹽水，后12 d按5 mg/kg劑量腹腔注射氟西汀;對(duì)照組注射等體積生理鹽水。

2.2抑郁癥評(píng)估 (1)體重測定：造模前以及造模后第6、12、18和24天稱取大鼠體重；(2)曠場試驗(yàn)：造模后第24天行曠場試驗(yàn)觀察大鼠水平運(yùn)動(dòng)，4只腳水平跨過計(jì)算為1次，每5 min累積一次；(3)NE水平檢測：造模后第24天，取大鼠的血清和海馬組織，利用ELISA試劑盒檢測NE含量。

2.3細(xì)胞培養(yǎng) (1)新生大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)：對(duì)新生大鼠進(jìn)行消毒、大腦半球暴露處理，分開皮層取兩側(cè)海馬組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm小塊后用胰蛋白酶消化,當(dāng)組織塊消失后加入胎牛血清終止消化并離心出細(xì)胞,獲得的細(xì)胞沉淀用DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng); (2)PC12細(xì)胞培養(yǎng)：PC12細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中; (3)HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)：HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞放置細(xì)胞培養(yǎng)箱，于37 °C、5% CO2、濕化條件下培養(yǎng)，隔天更換新鮮培養(yǎng)基。

2.4miR-381-3p inhibitor轉(zhuǎn)染 將新生大鼠海馬神經(jīng)元接種至6孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%融合時(shí)，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒，將miR-381-3p inhibitor或者陰性對(duì)照序列(miRNA-NC)轉(zhuǎn)染至神經(jīng)元細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.5MTT法檢測細(xì)胞活力 已轉(zhuǎn)染miR-381-3p inhibitor的海馬神經(jīng)元在含CORT的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行MTT檢測。移去含CORT的DMEM培養(yǎng)基，加入含MTT的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h；孵育結(jié)束后，利用DMSO溶解甲臜結(jié)晶；溶解結(jié)束后，在570 nm處檢測各樣本的吸光度(A)值。

2.6Real-time PCR檢測miR-381-3p和BDNF mRNA的表達(dá) 利用Trizol試劑分別提取海馬組織和海馬神經(jīng)元中的總RNA, 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)；miR-381-3p的表達(dá)量以U6為內(nèi)參照，BDNF mRNA的表達(dá)量以β-actin為內(nèi)參照，表達(dá)量計(jì)算均按照2-ΔΔCt法。

2.7Western blot檢測BDNF、Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá) 利用RIPA細(xì)胞裂解液提取各組大鼠海馬組織以及細(xì)胞中總蛋白，BCA法定量總蛋白后，取等量各組樣本進(jìn)行10% SDS-PAGE；將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；對(duì)膜先進(jìn)行2 h的封閉，再孵育I抗于4 °C條件過夜；第2天取出膜于室溫下孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗；蛋白條帶通過ECL化學(xué)發(fā)光劑顯示、拍照。

2.8螢光素酶報(bào)告基因分析 根據(jù)生物信息學(xué)軟件預(yù)測BDNF啟動(dòng)子上miR-381-3p的結(jié)合位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增靶啟動(dòng)子片段，插入螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒中，構(gòu)建pGL3-BDNF 3’-UTR螢光素酶基因報(bào)告載體；PC12細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞分別接種至24孔板上，待生長至80%融合，共轉(zhuǎn)染miR-381-3p和pGL3-BDNF 3’-UTR螢光素酶載體；轉(zhuǎn)染24 h后，檢測螢光素酶活性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 氟西汀對(duì)抑郁癥大鼠的治療效果

抑郁癥大鼠造模成功的指標(biāo)是體重下降、曠場活動(dòng)次數(shù)減少及去甲腎上腺素水平下降。與模型組相比，治療組大鼠體重逐漸恢復(fù)，在治療的第7天(即造模后第18天)顯著增加并持續(xù)到治療后第13天，見圖1；治療第24天，治療組大鼠水平活動(dòng)次數(shù)顯著增加，血清和海馬區(qū)域NE含量均顯著增加(P<0.01)，見圖2、3。

Figure 1. The changes of body weight in the rats. Mean±SD.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖1大鼠體重的變化

2 海馬組織分子表達(dá)情況

與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬組織miR-381-3p表達(dá)顯著增加，BDNF的 mRNA及蛋白水平顯著下降，凋亡抑制因子Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，凋亡促進(jìn)因子Bax蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，治療組海馬組織miR-381-3p表達(dá)顯著下調(diào)，BDNF的mRNA及蛋白水平顯著上升，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，見圖4、5。

3 沉默miR-381-3p對(duì)海馬神經(jīng)元活力的影響

CORT處理可促使海馬神經(jīng)元活力顯著下降；而CORT對(duì)神經(jīng)元的毒性可被miR-381-3p沉默逆轉(zhuǎn)，促進(jìn)細(xì)胞活力增強(qiáng)(P<0.01)，見圖6。

Figure 2. The number of cross-field activities. Mean±SD.**P< 0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

圖2大鼠曠場試驗(yàn)水平活動(dòng)次數(shù)的比較

Figure 3. The content of norepinephrine (NE). Mean±SD.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

圖3NE含量的變化

Figure 4. The expression of BNDF mRNA and miR-381-3p in the hippocampus. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

圖4海馬組織miR-381-3p和BDNFmRNA的表達(dá)

4 沉默miR-381-3p對(duì)海馬神經(jīng)元中BDNF、Bcl-2及Bax表達(dá)的影響

CORT處理可促使海馬神經(jīng)元中miR-381-3p表達(dá)顯著上調(diào)，BDNF mRNA水平顯著下調(diào)；而CORT對(duì)miR-381-3p和BDNF mRNA表達(dá)的影響可被miR-381-3p沉默所逆轉(zhuǎn)，促使miR-381-3p表達(dá)顯著下降，BDNF的mRNA水平顯著上調(diào)(P<0.01)，見圖7。

Figure 5. The protein expression of BNDF, Bcl-2 and Bax in the hippocampus. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;

##P<0.01vsmodel group.

圖5海馬組織BDNF、Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)

Figure 6. The viability of hippocampal neurons. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCORT+miRNA-NC group.

圖6細(xì)胞活力的檢測

Figure 7. The expression of miR-381-3p and BDNF mRNA in the hippocampal neurons. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCORT+miRNA-NC group.

圖7沉默miR-381-3p對(duì)海馬神經(jīng)元中miR-381-3p和BDNFmRNA表達(dá)的影響

同時(shí)，miR-381-3p沉默逆轉(zhuǎn)了CORT對(duì)BDNF、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響，促進(jìn)了BDNF和Bcl-2的表達(dá)，抑制了Bax的表達(dá)(P<0.01)，見圖8。

Figure 8. The protein expression of BDNP, Bcl-2 and Bax in the hippocampal neurons. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCORT+miRNA-NC group.

圖8沉默miR-381-3p的海馬神經(jīng)元中BDNF、Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)

5 miR-381-3p靶向BDNF的驗(yàn)證

miR-381-3p與BDNF 3’-UTR區(qū)有潛在配對(duì)序列區(qū)域。螢光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，miR-381-3p抑制BDNF轉(zhuǎn)錄活性，見圖9。

討 論

抑郁癥一種嚴(yán)重影響患者生命、增加家庭負(fù)擔(dān)的慢性神經(jīng)精神障礙類疾病。目前臨床抑郁癥治療效果仍不理想，藥物治療代替電休克治療方法為患者帶來福音，但藥物產(chǎn)生的毒副作用對(duì)患者造成不良后果。因此，從探討抑郁癥發(fā)生機(jī)制出發(fā)，尋找抗抑郁癥的新的治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。從逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元損傷角度改善抑郁癥癥狀的方法已有研究，有望成為一個(gè)安全有效的治療策略。分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展為疾病治療提供的一個(gè)新的研究方向。探討疾病發(fā)生的機(jī)制，尋找有效的治療基因靶點(diǎn)，具有疾病治療的潛在意義。通過敲除靶基因調(diào)控基因表達(dá)的方法，在調(diào)控心血管疾病、腫瘤和腦部疾病發(fā)生過程中的作用已有大量研究[13-15]。本研究探討miR-381-3p和其靶向調(diào)控的BDNF在改善大鼠抑郁癥中的作用，發(fā)現(xiàn)沉默miR-381-3p可減輕大鼠海馬神經(jīng)元的CORT損傷。

Figure 9. miR-381-3p targeted regulation of BNDF expression. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖9螢光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證miR-381-3p靶向調(diào)控BDNF

既往研究發(fā)現(xiàn)miR-381-3p是一個(gè)腫瘤相關(guān)miRNA分子。在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、生長和侵襲中起重要作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)miR-381-3p在調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化方面也發(fā)揮作用。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在氟西汀治療抑郁癥大鼠的海馬區(qū)組織中，miR-381-3p表達(dá)顯著受到抑制，表明miR-381-3p可能與抑郁癥發(fā)生以及治療有關(guān)。氟西汀是臨床抑郁癥常用藥物，可以通過增加突觸間隙中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量改善抑郁癥的指征[16]。近期研究發(fā)現(xiàn)氟西汀能減輕各種有害因素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害作用，也保護(hù)神經(jīng)元免受CORT毒性[3, 5]。那么，我們?cè)诜魍≈委熃M發(fā)現(xiàn)的受氟西汀抑制表達(dá)的miR-381-3p是否參與抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元免受CORT損傷過程仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，我們培養(yǎng)了新生大鼠海馬神經(jīng)元，并沉默細(xì)胞中miR-381-3p，觀察其對(duì)CORT處理后的神經(jīng)元活力的影響。我們發(fā)現(xiàn)miR-381-3p沉默逆轉(zhuǎn)了CORT的效應(yīng)，增加的細(xì)胞存活率，同時(shí)促進(jìn)了凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)并抑制了凋亡促進(jìn)蛋白Bax的表達(dá)。這些結(jié)果表明沉默miR-381-3p在保護(hù)海馬神經(jīng)元、減輕抑郁癥損傷中起了關(guān)鍵作用。

另外，我們還發(fā)現(xiàn)BDNF是miR-381-3p靶向調(diào)控分子。BDNF是一個(gè)神經(jīng)損傷和修復(fù)相關(guān)的分子，在抑郁癥病理生理發(fā)生過程中起至關(guān)重要的作用。BDNF信號(hào)通路在抑郁癥大鼠海馬區(qū)水平下調(diào)，而這種下調(diào)可被抗抑郁癥藥物氟西汀逆轉(zhuǎn)[17]。BDNF基因敲除小鼠表現(xiàn)出對(duì)輕度應(yīng)激的易感性[18]。而接受側(cè)腦室BDNF治療的大鼠表現(xiàn)長時(shí)間持續(xù)的抗抑郁效果[19]。鑒于此，靶向調(diào)控BDNF有可能成為抗抑郁癥治療途徑。本研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元CORT毒性實(shí)驗(yàn)中，BDNF可被miR-381-3p靶向調(diào)控。

綜上所述，在氟西汀治療CORT-抑郁癥大鼠過程中可促使miR-381-3p/BDNF通路受抑制。miR-381-3p沉默可通過促進(jìn)BDNF表達(dá)保護(hù)神經(jīng)元，減輕CORT對(duì)神經(jīng)元的損傷。miR-381-3p有可能成為抗抑郁癥治療的潛在靶點(diǎn)。

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