周林裕， 謝萬福， 代永慶， 包志軍， 胡 驍， 包春燕

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬3201醫(yī)院神經(jīng)外科， 陜西 漢中 723000； 2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科， 陜西 西安 710061； 3西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬3201醫(yī)院產(chǎn)科， 陜西 漢中 723000)

腦膠質(zhì)瘤是常見的起源于神經(jīng)外胚層的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，惡性程度高、死亡率高及治愈率低，目前多采用外科治療與放化療相結(jié)合的療法，但治療效果并不理想[1-2]。膠質(zhì)瘤的發(fā)病由多種原癌基因和抑癌基因的功能和結(jié)構(gòu)異常引起，是一種多基因的異常疾病。從分子生物學(xué)角度研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，因能結(jié)合于靶基因啟動子序列的X盒而得名[3]。XBP1基因與肝癌和乳腺癌等人類多種腫瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系[4-5]。XBP1過表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌的生長和增殖[6]，且與人食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[7]。然而，XBP1基因在腦膠質(zhì)瘤中的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境可上調(diào)XBP1的表達(dá)，沉默其表達(dá)可降低細(xì)胞活力和糖酵解，機(jī)制與上調(diào)過氧化氫有關(guān)，而過表達(dá)XBP1反之，可作為腦膠質(zhì)瘤候選的分子靶點[8-9]，但其對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及機(jī)制研究的還未清楚。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA誘導(dǎo)的、高度保守的、同源mRNA高特異性降解的現(xiàn)象，作為一種有效的基因阻斷技術(shù)，對研究基因功能是較好的途徑，目前已得到廣泛應(yīng)用[10-12]。本研究中首先檢測了XBP1基因在腦膠質(zhì)瘤組織和瘤旁組織的表達(dá)情況，接著通過RNAi技術(shù)抑制其表達(dá)，觀察細(xì)胞活力、周期及凋亡的變化，并進(jìn)一步研究對其增殖相關(guān)蛋白增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、周期相關(guān)蛋白細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(serine/protein kinase B，PKB；又稱Akt)信號通路的影響，為腦膠質(zhì)瘤的分子診斷及靶向治療提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 標(biāo)本及細(xì)胞來源

44例腦膠質(zhì)瘤組織及相應(yīng)的瘤旁組織(距離腫瘤1 cm以上)來源于2014年3月～2016年7月西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科患者，其中男性26例，女性18例，年齡10～66歲，平均年齡36.9歲。所有腫瘤組織經(jīng)過病理證實，且有完整的臨床資料，所有患者術(shù)前均未行放療和化療。組織標(biāo)本切除后置于-80 ℃冰箱保存。所有樣品的采集均經(jīng)過患者和家屬及醫(yī)院的倫理學(xué)通過。人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

2 主要試劑和儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、TRIzol和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購自Invitrogen；胎牛血清購自HyClone；CCK-8試劑盒購自Promega；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自北京天根；膜聯(lián)蛋白V-FITC(annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；抗XBP1、PCNA、Bcl-2、 Bax、cyclin D1、PI3K和磷酸化Akt(phosphorylated, p-Akt)抗體均購自Abcam。酶標(biāo)儀和流式細(xì)胞儀均購自Bio-Rad；熒光定量PCR儀購自Bioneer。

3 方法

3.1qPCR檢測腦膠質(zhì)瘤組織中XBP1的mRNA表達(dá) TRIzol法提取腦膠質(zhì)瘤及瘤旁組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參照，cDNA為模板，按照試劑盒的操作說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Oligo 7.0軟件設(shè)計XBP1和GAPDH的qPCR引物，所有引物由上海生工合成。XBP1的上游引物序列為5’-CCTGGTTGCTGAAGAGGAGG-3’， 下游引物序列為5’-CCATGGGGAGATGTTCTGGAG-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-ATGACCCCTTCATTGACC-3’，下游引物序列為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。 PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、60 ℃ 35 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸15 min，4 ℃保存。實驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計。

3.2細(xì)胞培養(yǎng) U251細(xì)胞在37 ℃、5% CO2、95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中用含有10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。實驗為生長至對數(shù)期的細(xì)胞。

3.3siRNA轉(zhuǎn)染及分組 以每孔5×104將生長至對數(shù)期的U251細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2環(huán)境中用含有10%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，細(xì)胞生長至80%～90%融合進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明進(jìn)行操作。細(xì)胞分為正常對照(control)組(細(xì)胞無特殊處理)，陰性對照(negative control-siRNA，NC-siRNA)組(轉(zhuǎn)染不具有任何干擾作用的siRNA)和XBP1-siRNA組(轉(zhuǎn)染干擾XBP1表達(dá)的siRNA)。

3.4Western blot實驗 收集轉(zhuǎn)染48 h的3組細(xì)胞，用qPCR檢測3組細(xì)胞中XBP1的mRNA表達(dá)，檢測方法同3.1；Western blot法檢測XBP1的蛋白表達(dá)，操作步驟如下：細(xì)胞加入3～5倍預(yù)冷RIPA細(xì)胞裂解液制成勻漿，離心后取上清。取少量蛋白樣品BCA試劑盒檢測蛋白濃度。每泳道30 μg蛋白樣品經(jīng)10%的SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉封閉，4 ℃孵育抗XBP1、PCNA、Bcl-2、Bax、cyclin D1、PI3K、p-Akt(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶5 000稀釋)抗體過夜，充分洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，再次洗膜后置于暗室中顯影、定影。

3.5CCK-8實驗檢測細(xì)胞活力 收集轉(zhuǎn)染48 h的3組細(xì)胞，每孔細(xì)胞中加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育4 h?？瞻讓φ湛渍{(diào)零，酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(A570)。實驗重復(fù)3次。計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞相對活力(%)=實驗組細(xì)胞A值/空白對照組細(xì)胞A值×100%。

3.6流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期分布 取轉(zhuǎn)染48 h的3組細(xì)胞，吸出原有培養(yǎng)基，磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞后胰蛋白酶消化2～5 min，細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×109/L，75% 4 ℃預(yù)冷的乙醇固定細(xì)胞48 h，離心棄上清，磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，加入50 μL RNase (0.5 g/L)，37 ℃水浴30 min，磷酸緩沖液洗滌后重懸細(xì)胞，加入50 μL PI (1 g/L)，4 ℃避光反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期，觀察G1期、S期和G2期細(xì)胞各占的百分比，觀察是否存在凋亡細(xì)胞及其所占比例。

3.7細(xì)胞凋亡檢測 收集轉(zhuǎn)染48 h的3組細(xì)胞，預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞，0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞密度調(diào)整為1×109/L，加入10 μL的annexin V-FITC，室溫暗室染色15 min，上機(jī)前5 min加入10 mg/L的PI染液5 μL，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡情況。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組比較用獨(dú)立樣本t檢驗，多組間差異比較采用單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 XBP1在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

qPCR檢測XBP1 mRNA在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，XBP1在腦膠質(zhì)瘤組織中的mRNA表達(dá)顯著高于瘤旁組織(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The mRNA expression of XBP1 in the brain glioma tissues. Mean±SD.n=44.*P<0.05vsperi-tumo-rous.

圖1XBP1mRNA在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

2 轉(zhuǎn)染XBP1-siRNA后的U251細(xì)胞XBP1的表達(dá)

qPCR檢測轉(zhuǎn)染XBP1-siRNA后U251細(xì)胞XBP1的mRNA表達(dá)，Western bloting檢測蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，NC-siRNA組XBP1的mRNA及蛋白表達(dá)與control組差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，而XBP1-siRNA組XBP1的mRNA及蛋白表達(dá)均顯著低于control組和NC-siRNA組(P<0.05)，見圖2。

3 下調(diào)XBP1表達(dá)降低U251細(xì)胞活力

CCK-8法檢測細(xì)胞活力的結(jié)果顯示，NC-siRNA組的細(xì)胞存活率與control組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，而XBP1-siRNA組的細(xì)胞存活率顯著低于control組和NC-siRNA組(P<0.05)，見圖3。

4 下調(diào)XBP1表達(dá)阻滯U251細(xì)胞周期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，NC-siRNA組的G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞及細(xì)胞凋亡率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，而XBP1-siRNA組的G0/G1期細(xì)胞顯著高于control組和NC-siRNA組，S期細(xì)胞顯著低于control組NC-siRNA組，細(xì)胞凋亡率顯著高于control組NC-siRNA組(P<0.05)，見圖4。

Figure 2. The mRNA (A) and protein (B) expression of XBP1 in the U251 cells transfected withXBP1-siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2轉(zhuǎn)染XBP1-siRNA后U251細(xì)胞XBP1的表達(dá)

Figure 3. The effect of down-regulation of XBP1 expression on the viability of U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3下調(diào)XBP1表達(dá)對U251細(xì)胞活力的影響

5 下調(diào)XBP1對PCNA、cyclin D1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測增殖相關(guān)蛋白PCNA、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax及細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，NC-siRNA組PCNA、cyclin D1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)與control組差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，XBP1-siRNA組PCNA、cyclin D1和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于control組和NC-siRNA組(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)顯著高于control組和NC-siRNA組(P<0.05)，見圖5。

6 下調(diào)XBP1表達(dá)抑制PI3K/Akt信號通路

Western blot檢測PI3K/Akt信號通路PI3K和p-Akt的蛋白水平，結(jié)果示，NC-siRNA組PI3K和p-Akt的蛋白水平與control組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；XBP1-siRNA組PI3K和p-Akt的蛋白水平均顯著低于control組和NC-siRNA組(P<0.05)，見圖6。

討 論

腦膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)腫瘤，具有易復(fù)發(fā)及侵襲性的特性，由于其生長部位的特殊性，手術(shù)及放化療藥物均很難達(dá)到預(yù)期效果，而使腦膠質(zhì)瘤成為神經(jīng)系統(tǒng)難以治療疾病之一[13-14]。腫瘤的發(fā)生是一個多階段、多因素的復(fù)雜過程，包括抑癌基因、癌基因、DNA損傷修復(fù)基因的表觀遺傳變異及突變。XBP1是一個重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號通路中的轉(zhuǎn)錄因子，屬于ATF/CREB轉(zhuǎn)錄因子家族中一員，參與未折疊蛋白反應(yīng)[15-16]。研究表明，在多種腫瘤中XBP1有高表達(dá)，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17-18]，抑制XBP1的表達(dá)可降低腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[19-20]，如抑制人多發(fā)性骨髓瘤中XBP1的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[21]。腦膠質(zhì)瘤中XBP1的表達(dá)顯著高于在正常腦組織中的表達(dá)，XBP1可通過上調(diào)抗氧化分子對膠質(zhì)瘤的抗氧化應(yīng)激損傷起保護(hù)作用，抑制其表達(dá)并聯(lián)合使用活性氧誘導(dǎo)劑三氧化二砷可協(xié)同治療腦膠質(zhì)瘤[22-23]。XBP1對腦膠質(zhì)瘤潛在的作用還未清楚。

為了研究XBP1在腦膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)特性，本研究首先檢測了腦膠質(zhì)瘤組織相對于瘤旁組織的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤組織中XBP1的表達(dá)顯著高于瘤旁組織。關(guān)于抑制XBP1表達(dá)對腦膠質(zhì)瘤生物學(xué)特性的影響研究還未清楚。因此，通過RNA干擾技術(shù)抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中XBP1的表達(dá)，檢測細(xì)胞活力、周期及凋亡的變化，發(fā)現(xiàn)XBP1的表達(dá)受到抑制后細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡增加，且發(fā)生G1期阻滯。細(xì)胞增殖、凋亡和周期受到多種基因的調(diào)控。PCNA為增殖期細(xì)胞特異性表達(dá)的核蛋白，特異性S期的標(biāo)志，其表達(dá)與合成與細(xì)胞增殖率、腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲能力及DNA合成密切相關(guān)，已在多種腫瘤中作為檢測細(xì)胞增殖的標(biāo)志[24-25]。Cyclin D1是G1期細(xì)胞周期素，主要促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S檢查點，作為在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中正調(diào)控細(xì)胞周期的重要因子發(fā)揮作用，目前已在多種腫瘤中被證實是檢測預(yù)后的重要指標(biāo)[26-27]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在內(nèi)源及外源信號刺激后所發(fā)生的一種程序性死亡過程，在眾多疾病，尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中具有重要作用。Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，其家族成員的比率對細(xì)胞凋亡起關(guān)鍵作用，尤其是Bcl-2/Bax的比例是啟動細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。Bcl-2是Bcl-2家族的抑凋亡基因，Bax是Bcl-2家族的促凋亡基因。Bcl-2和Bax可以通過形成異源或同源二聚體調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bcl-2表達(dá)減少而Bax表達(dá)增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，反之則抑制細(xì)胞凋亡[28-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，XBP1的表達(dá)受到抑制后，PCNA、Bcl-2和cyclin D1蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)。這提示抑制XBP1表達(dá)降低細(xì)胞活力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及阻滯細(xì)胞周期的方式是下調(diào)PCNA、Bcl-2和cyclin D1表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)。

Figure 4. Effects of down-regulation of XBP1 expression on cell cycle and apoptosis of the U251 cells. A: the quantitative analysis of the cell cycle distribution; B: the images of flow cytometry for detecting the cell apoptosis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4下調(diào)XBP1表達(dá)對U251細(xì)胞周期及凋亡的影響

Figure 5. The effect of down-regulation of XBP1 on the protein expression of PCNA, Bcl-2, Bax and cyclin D1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5下調(diào)XBP1對PCNA、Bcl-2、Bax和cyclinD1蛋白表達(dá)的影響

Figure 6. The effect of down-regulation of XBP1 expression on PI3K/Akt signaling pathway. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖6下調(diào)XBP1表達(dá)對PI3K/Akt信號通路的影響

PI3K/Akt信號通路是一個經(jīng)典的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中有重要作用，其通路中相關(guān)的分子及基因表達(dá)異常可引起腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲的異常[31]。在多種腫瘤中 PI3K/Akt信號通路處于激活狀態(tài)，如胃癌、腦膠質(zhì)瘤和卵巢癌等，其激活可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[32-34]。腦膠質(zhì)瘤中抑制PI3K/Akt信號通路可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及促進(jìn)其凋亡[35-36]。PI3K在細(xì)胞中廣泛存在，其激活可促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化和抑制細(xì)胞凋亡，通過激活磷酸化的Akt抑制或激活下游靶蛋白而發(fā)揮抗凋亡作用。XBP1是否可通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性還未可知。因此，本研究檢測了PI3K/Akt信號通路PI3K和p-Akt的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)抑制XBP1基因表達(dá)可顯著降低PI3K和p-Akt的蛋白水平。

綜上所述，XBP1基因在腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，抑制其表達(dá)可通過下調(diào)PI3K/Akt信號通路降低腫瘤細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞于G1期，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡;其抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及阻滯細(xì)胞周期的機(jī)制是下調(diào)PCNA、Bcl-2和cyclin D1表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)。本研究為進(jìn)一步探討XBP1在腦膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)特性提供了實驗數(shù)據(jù)，可能是腦膠質(zhì)瘤治療的一個理想分子靶點，其它的生物學(xué)特性及在體內(nèi)實驗的作用值得進(jìn)一步深入探討。

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