熊希倩，詹江華

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）以肝內(nèi)、外膽管梗阻，進行性炎癥及肝纖維化為主要病理特征，早期行葛西（Kasai）手術(shù)雖可改善膽汁淤積，但不能終止肝纖維化進程［1-2］。膽管上皮細胞受損后，可引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，使膽管細胞破壞、增殖和膽管結(jié)構(gòu)重建［3］。研究表明，增生的膽管細胞以非成熟膽管上皮細胞為主，而這些不成熟膽管上皮細胞在短時間內(nèi)迅速增生，可能是BA膽管纖維化迅速惡化的主要原因［4］。本文就膽管細胞破壞及其修復(fù)過程進行綜述。

1 膽管結(jié)構(gòu)改變

膽管分為肝內(nèi)膽管和肝外膽管，Kasai手術(shù)能夠解除肝外膽道梗阻癥狀，但無法改變肝內(nèi)膽管結(jié)構(gòu)，因此BA患兒在Kasai術(shù)后仍表現(xiàn)為進行性肝內(nèi)小膽管破壞、膽汁淤積、肝硬化。BA肝內(nèi)膽管早期改變?yōu)閰R管區(qū)水腫、膽管增生、毛細膽管淤膽、中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，部分可見匯管區(qū)周圍肝細胞化生為膽管細胞，與增生膽管相互連接；晚期大量間質(zhì)成分增生，匯管區(qū)出現(xiàn)纖維化及橋接壞死，膽管管腔狹窄或閉鎖，膽管上皮細胞正常結(jié)構(gòu)受到破壞。電鏡下超微結(jié)構(gòu)可見膽管上皮細胞變性、空泡形成、細胞核固縮、胞質(zhì)萎縮及基底膜增厚、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、線粒體腫脹、毛細膽管上皮微絨毛缺失或形態(tài)異常，以上為BA肝內(nèi)膽管基本病變［5］。Obayashi等［6］利用門管區(qū)膽管數(shù)量/門管區(qū)測量面積（the number of the bile ducts in the portal canal/measured surface area of the portal canal，BDP）比值作為BA患者Kasai術(shù)后預(yù)后指標，發(fā)現(xiàn)預(yù)后差（死亡或肝移植）的BDP比值為1.19±0.42，而預(yù)后好（自體肝生存）的BDP比值為1.64±0.53（P=0.04），說明膽管數(shù)量與BA預(yù)后密切相關(guān)。劉丹丹等［7］證實Kasai術(shù)后肝門區(qū)膽管直徑總和大于300 μm的BA患兒比膽管直徑總和小于100 μm者預(yù)后好。然而能通暢引流膽汁功能的肝內(nèi)膽管的直徑和數(shù)量，以及肝內(nèi)膽管的直徑、數(shù)量與BA預(yù)后的關(guān)系等方面研究報道較少。

2 膽管上皮細胞破壞

2.1 圍生期病毒感染 圍生期多種病毒感染均與BA相關(guān)，其中輪狀病毒感染與BA關(guān)系的研究較為深入，不僅在BA患兒肝臟檢測到了輪狀病毒，新生鼠感染輪狀病毒還能制作出小鼠的BA模型。德國學(xué)者Petersen［8］給新生鼠腹腔注射恒河猴輪狀病毒（rhesus monkeys rotavirus，RRV），可觀察到約75%的新生鼠發(fā)生與人類BA完全一致的肝內(nèi)外膽管損傷，現(xiàn)已成為目前研究BA發(fā)病機制的標準模型［9-12］。RRV是一種二十面體、無包膜、雙鏈RNA病毒，具有三層蛋白質(zhì)衣殼（VP4、VP6和VP7）。Lobeck等［10］發(fā)現(xiàn)輪狀病毒誘導(dǎo)的BA小鼠會依賴VP6蛋白引起的細胞外信號相關(guān)激酶（ERK）磷酸化，并引發(fā)鈣內(nèi)流，促進病毒在膽管細胞中復(fù)制，病毒產(chǎn)量不斷增加。

輪狀病毒受體包括整聯(lián)蛋白α2β1、α4β1、αVβ3和αXβ2，整聯(lián)蛋白是一類分布廣泛的黏附受體，可以激活多種信號通路，從而在細胞黏附、增殖、分化、遷移、抗細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4（non structural protein 4，NSP4）是由第10位基因編碼的跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜糖蛋白，其對病毒的形態(tài)發(fā)生、復(fù)制及致病機制具有重要作用［13］。鄭帥玉等［14］通過激光共聚焦方法檢測到肝外膽管上皮細胞表面表達整聯(lián)蛋白α2β1，進一步證實輪狀病毒NSP4和整聯(lián)蛋白α2亞基共區(qū)域存在于肝外膽管上皮細胞胞質(zhì)內(nèi)，并且輪狀病毒NSP4從感染細胞向緊鄰的非感染細胞進行擴散，即整聯(lián)蛋白α2β1可以與輪狀病毒NSP4相互作用，并進一步導(dǎo)致肝外膽管上皮細胞損傷。

除輪狀病毒外，巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）、呼吸道腸道病毒等也與BA膽管上皮細胞的損傷有關(guān)，且有報道顯示在BA血液或組織中檢測到CMV感染的發(fā)生［15-16］，這為病毒感染引發(fā)BA提供了循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

2.2 免疫炎癥反應(yīng) 目前研究證實，γ-干擾素（IFN-γ）、CD8+T淋巴細胞、自然殺傷（NK）細胞、巨噬細胞以及調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）均與輪狀病毒引起的新生鼠肝內(nèi)外膽管損傷有關(guān)，清除CD8+T淋巴細胞、NK細胞、Tregs或阻斷IFN-γ的表達后輪狀病毒均不能造成新生鼠膽管損傷，由此推斷輪狀病毒引起B(yǎng)A并不僅僅是對膽管上皮細胞的直接破壞所致，由輪狀病毒感染引發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)可能才是BA形成的真正原因［17］。

病毒感染時，機體會調(diào)動固有的免疫反應(yīng)來對抗病毒的入侵，當免疫炎癥反應(yīng)紊亂，就會造成膽管上皮細胞的損傷［17］。Okamura等［18］利用雙鏈 RNA（dsRNA）類似物聚肌胞苷酸（poly I∶C）感染人BA膽管上皮細胞誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)膽管上皮細胞有Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）的高表達。Shimada等［19］認為TLR3-NK-κB/IRF3-CCL5通路（圖1）可能是BA膽管上皮細胞固有免疫反應(yīng)中的重要通路，病毒入侵機體后合成大量的dsRNA中間體，膽管上皮細胞中識別dsRNA，激活核因子（NF）-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3），從而誘導(dǎo)產(chǎn)生趨化因子CCL5，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致膽管上皮細胞的破壞。

Fig.1 Proposed role of CCL5 in the pathogenesis of dsRNA virusmediated BA圖1 CCL5在dsRNA病毒介導(dǎo)的BA發(fā)病機制中的作用

膽管上皮細胞受損后，激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，延長激酶的激活時間，導(dǎo)致細胞因子白細胞介素（IL）-6和IL-8的不平衡表達［20］。IL-6在肝損傷時從膽管上皮細胞釋放出來，直接促進細胞增殖，使細胞存活和再生［21］。血清IL-6的濃度與BA的嚴重程度有關(guān)［22］。伴有嚴重黃疸和門靜脈高壓的BA患兒血清中IL-8濃度顯著升高［23］。MAPK通路激活后，多種免疫細胞也被激活，活化的免疫細胞能直接殺傷或分泌多種細胞因子，損傷被感染的膽管上皮細胞［20］。Brindley等［24］發(fā)現(xiàn)BA患兒中Tregs的表達量低于正常對照，而Tregs的缺乏會使炎癥反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)增強，最終導(dǎo)致膽管上皮細胞破壞和膽管損傷。Shivakumar等［25］發(fā)現(xiàn)NK細胞和CD8+T淋巴細胞能通過分泌穿孔素和顆粒酶使兩者產(chǎn)生協(xié)同作用，導(dǎo)致膽管上皮細胞損傷；可見膽管上皮細胞的炎癥和免疫損傷是造成膽管纖維化改變的主要原因。

3 膽管修復(fù)

膽管修復(fù)過程包括膽管上皮細胞增生和膽管結(jié)構(gòu)重建，其病理學(xué)特征是出現(xiàn)活性膽管細胞?；钚阅懝芗毎c正常的膽管細胞相比具有特殊的生物學(xué)特性，前者具有一定程度的“可塑性”，表現(xiàn)為上皮細胞分泌和屏障功能缺乏，以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物的表達［26-27］?；钚阅懝芗毎軌虍a(chǎn)生大量的可溶性介質(zhì)，導(dǎo)致大量炎癥細胞（巨噬細胞、NK細胞、固有淋巴細胞）和間充質(zhì)細胞（肝星狀細胞、成纖維母細胞）的聚集，形成肝臟修復(fù)復(fù)合物［3］。

BA患兒早期膽管上皮增生時要比靜止時分泌更多的細胞因子，包括細胞黏附因子（CAM）、血小板衍生因子（PDGF）、炎癥因子，如轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、IFN-γ等。而這些細胞因子又趨化更多的基質(zhì)細胞及炎癥細胞浸潤，引發(fā)瀑布或鏈鎖式炎癥反應(yīng)，加速了膽管受損、閉塞，直至纖維化的發(fā)生。Jun等［28］發(fā)現(xiàn)IL-33參與人類膽管上皮細胞的增生過程，IL-33/2型固有淋巴細胞（ILC2）/IL-13通路的激活促進BA小鼠模型的膽管修復(fù)。膽管細胞增生是膽管上皮細胞受損后的病理生理反應(yīng)，但這些增生膽管是否有引流膽汁的功能值得關(guān)注。Song等［29］發(fā)現(xiàn)癌癥亮氨酸拉鏈下調(diào)因子1（leucine zipper downregulated in cancer 1，LDOCl）基因表達上調(diào)可以促進NF-κB入核，轉(zhuǎn)錄并激活下游炎癥因子IL-2和腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達，導(dǎo)致膽道上皮細胞發(fā)生炎癥損傷，進而抑制膽管上皮細胞凋亡，小膽管阻塞，最終導(dǎo)致膽汁淤積這一BA特有的臨床病理表現(xiàn)。Zhang等［4］用CD56來標記未成熟的膽管上皮細胞，發(fā)現(xiàn)新形成未成熟的膽管或小膽管沒有膽汁運輸功能，膽汁無法正常引流，最終形成膽栓。

4 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與肝纖維化的關(guān)系

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelium mesenchymal transi?tion，EMT）指在外界因素作用下，上皮細胞失去極性，變成間葉細胞獨特的紡錘型的現(xiàn)象。在四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，發(fā)現(xiàn)間葉細胞標志物（如α平滑肌肌動蛋白、纖連蛋白等）表達均上調(diào)［30］，而上皮細胞標志物（如CK-19等）表達下調(diào)［31］，肝細胞開始表達促進EMT的轉(zhuǎn)錄因子snail［32］。Xue等［33］提出可以通過誘導(dǎo)產(chǎn)生有關(guān)細胞因子和生長因子的變化而逆轉(zhuǎn)或者減弱EMT過程。眾所周知，TGF-β1是肝纖維化過程中的敏感因子，可促進組織纖維化。實驗發(fā)現(xiàn)TGF-β1可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小鼠肝細胞發(fā)生EMT，導(dǎo)致細胞表型轉(zhuǎn)化和膠原沉積［34］。目前認為各種因素導(dǎo)致的膽管上皮細胞發(fā)生EMT是導(dǎo)致肝纖維化的主要病理進程之一［35］。

5 總結(jié)和展望

病毒入侵機體引起B(yǎng)A，不僅與病毒不斷復(fù)制引起膽管上皮細胞損傷有關(guān)，更主要是其引起膽管上皮細胞相關(guān)因子表達增高，從而引發(fā)一系列免疫炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致膽管的持續(xù)性損傷和肝纖維化的發(fā)生。膽管修復(fù)包括膽管細胞增生和膽管結(jié)構(gòu)重塑，但BA增生的膽管以未成熟膽管為主，基本沒有膽汁引流功能。而更多細胞因子的分泌，趨化更多的基質(zhì)細胞及炎性細胞的浸潤，引發(fā)鏈鎖式炎癥反應(yīng)，加速了膽管受損、閉塞，直至纖維化的發(fā)生。EMT在BA的發(fā)病機制中扮演著重要角色，抑制EMT相關(guān)分子的表達或許有助于阻止BA膽管纖維化進程。隨著BA膽管上皮細胞破壞和膽管修復(fù)機制研究的深入，如何促進增生膽管的成熟及阻止BA進程中各種因子介導(dǎo)的鎖鏈式炎癥反應(yīng)，將成為今后工作中需要解決的問題。

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