張寧男楠，張璋

腎腦表達(dá)蛋白（kidney and brain expressed protein，KIBRA）基因rs17070145單核苷酸多態(tài)性與人類記憶及阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）有關(guān)。歐美高加索健康人群的相關(guān)研究顯示，KIBRA基因多態(tài)性存在多種行為學(xué)測(cè)評(píng)及腦功能區(qū)差異，但研究存在不一致性［1-8］。因此本研究將基于功能連接密度（functional connective density，F(xiàn)CD）方法，分析天津地區(qū)漢族健康青年人群KIBRA基因多態(tài)性對(duì)記憶測(cè)評(píng)及腦功能連接的影響，并探討其病理生理機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 于2015年3—8月連續(xù)收集在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院查體的天津地區(qū)健康青年人。入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～35歲，漢族，性別不限，右利手，無(wú)神經(jīng)及精神系統(tǒng)疾患，無(wú)腦創(chuàng)傷、藥物和乙醇依賴史或其他可能影響腦結(jié)構(gòu)與功能的疾病。最終納入研究的267例受試者均具有完整的行為學(xué)、遺傳學(xué)資料和磁共振影像學(xué)數(shù)據(jù)，其中男118例，女149例，年齡18～29歲，中位年齡23（21，24）歲。本研究以書面形式告知受試者研究?jī)?nèi)容并征得同意，研究?jī)?nèi)容經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 行為學(xué)測(cè)評(píng)資料 （1）中國(guó)修訂版的韋氏記憶量表，包括①長(zhǎng)時(shí)記憶：1～100、100～1、積累；②短時(shí)記憶：圖片、再認(rèn)、再生、聯(lián)想、觸覺(jué)、理解；③瞬時(shí)記憶：背數(shù)；④記憶商數(shù)。（2）威斯康星卡片分類試驗(yàn)中的持續(xù)性錯(cuò)誤百分比。以上量表全面評(píng)估受試者的記憶及執(zhí)行功能。

1.3 遺傳學(xué)資料 KIBRA rs17070145基因型檢測(cè)：從3 000 μL全血中利用EZgeneTM血液gDNA小量提取試劑盒純化提取DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和連接酶檢測(cè)反應(yīng)（ligation detection reaction，LDR）檢測(cè)C/T等位基因（委托上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司完成）。

1.4 磁共振影像學(xué)數(shù)據(jù) 采用GE 3.0T Signa HDx磁共振掃描儀及8通道頭線圈，對(duì)所有受試者進(jìn)行全腦3D高分辨率T1結(jié)構(gòu)像和靜息態(tài)功能磁共振（functional magnetic resonance imaging，fMRI）掃描。全腦3D高分辨率T1WI結(jié)構(gòu)像采用顱腦容積成像序列進(jìn)行矢狀位掃描。掃描參數(shù)：重復(fù)時(shí)間/回波時(shí)間/反轉(zhuǎn)時(shí)間8.1/3.1/450.0 ms，視野256 mm×256 mm，矩陣256×256，翻轉(zhuǎn)角度（FA）13°，層厚1.0 mm，無(wú)間隔，層數(shù)176。靜息態(tài)fMRI采用梯度回波單次激發(fā)回波平面成像（echo planar imaging，EPI）技術(shù)。掃描參數(shù)：重復(fù)時(shí)間/回波時(shí)間2 000/30 ms，視野240 mm×240 mm，矩陣64×64，F(xiàn)A 90°，層厚4.0 mm，無(wú)間隔，層數(shù)40，采集180個(gè)時(shí)相。

1.5 數(shù)據(jù)處理

1.5.1 靜息態(tài)fMRI數(shù)據(jù)預(yù)處理 采用基于Matlab的SPM8進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。去除前10個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)。對(duì)剩余170個(gè)時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行層面時(shí)間校正和時(shí)間點(diǎn)之間的頭動(dòng)校正（去除三維平移超過(guò)2 mm、三維旋轉(zhuǎn)超過(guò)2°的受試者數(shù)據(jù)）。此外，計(jì)算不同時(shí)相之間頭動(dòng)位置的改變，即幀位移量（framewise displacement，F(xiàn)D），以反映某幀圖像相對(duì)于前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均位移量。隨后對(duì)每個(gè)受試者的結(jié)構(gòu)像和功能像線性配準(zhǔn)。采用3 mm再采樣進(jìn)行歸一化，并將個(gè)體頭像配準(zhǔn)到MNI（montreal neurological institute）標(biāo)準(zhǔn)空間。通過(guò)線性回歸，去除頭動(dòng)、腦白質(zhì)及腦脊液的平均信號(hào)。在0.01～0.08 Hz頻率范圍內(nèi)，通過(guò)帶通濾波去掉數(shù)據(jù)的線性漂移和高頻背景噪聲等非生理信號(hào)。

1.5.2 全腦FCD計(jì)算 經(jīng)過(guò)時(shí)間校正、頭動(dòng)校正及空間標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)用于計(jì)算FCD。基于Zhang等［9］研究，通過(guò)Linux平臺(tái)的內(nèi)部腳本計(jì)算FCD值，即某一體素與全腦其余灰質(zhì)體素間存在功能連接的個(gè)數(shù)?；驹硎钱?dāng)兩個(gè)體素的時(shí)間序列Pearson相關(guān)系數(shù)大于0.6時(shí)，認(rèn)為兩個(gè)體素間存在功能連接。在全腦灰質(zhì)模板內(nèi)得到每個(gè)體素FCD值后，除以全腦的平均FCD值，得到每個(gè)受試者標(biāo)準(zhǔn)化的全腦FCD（global FCD，gFCD），并利用全寬半高（full-width at half-maximum，F(xiàn)WHM）為8 mm的高斯核進(jìn)行空間平滑，進(jìn)一步提高數(shù)據(jù)的正態(tài)分布性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析數(shù)據(jù)。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)對(duì)所有連續(xù)變量數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。連續(xù)變量數(shù)據(jù)組間差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。分類變量組間比較采用χ2檢驗(yàn)。將性別、年齡、受教育年限作為協(xié)變量，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較C基因攜帶者和TT純合子攜帶者之間的差異，得到組間差異的gFCD腦區(qū)。該結(jié)果需要進(jìn)行蒙特卡洛模擬（Monte Carlo simulation）校正，校正的方法及參數(shù)為：每個(gè)體素閾值設(shè)定在P＜0.001，團(tuán)塊大小為≥64個(gè)體素時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（相當(dāng)于校正后閾值達(dá)到P＜0.05的效果），校正后的gFCD腦區(qū)作為最終結(jié)果。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人口學(xué)、基因及行為學(xué)數(shù)據(jù) 通過(guò)KIBRA基因分型檢測(cè)，267例受試者中，TT、TC、CC基因型攜帶者分別為155例（58.05%）、99例（37.08%）、13例（0.05%），T、C等位基因頻率為76.05%和23.41%；112例為C基因攜帶者，即TC+CC，基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.310，P＞0.05）。

TC+CC基因型組和TT型組間年齡、性別和受教育年限差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。韋氏記憶量表中，TC+CC基因型組代表長(zhǎng)時(shí)記憶測(cè)試的積累分測(cè)驗(yàn)得分高于TT基因型組（P=0.05），不同基因型組間其余各項(xiàng)測(cè)驗(yàn)評(píng)分及記憶商數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。威斯康星卡片分類試驗(yàn)中，不同基因型組間代表執(zhí)行功能的持續(xù)性錯(cuò)誤百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 基因型組間的全腦FCD分析 KIBRA C基因攜帶者（TC+CC）與TT純合子攜帶者間gFCD存在差異的腦區(qū)為右側(cè)枕中回（圖1A，峰值點(diǎn)MNI坐標(biāo)x=27，y=-75，z=36，團(tuán)塊大小64個(gè)體素，峰值點(diǎn)T值=4.139；校正后P＜0.05）。相對(duì)于TT純合子攜帶者，C基因攜帶者的FCD值增高（圖1B）。

3 討論

本研究對(duì)AD候選基因KIBRA在天津地區(qū)健康漢族人群中腦功能連接密度的影響進(jìn)行了探索性研究。結(jié)果表明，KIBRA不同基因型間存在記憶評(píng)分和腦功能的差異，TT純合子攜帶者的長(zhǎng)時(shí)記憶好于C基因攜帶者；兩個(gè)基因型的差異腦區(qū)為枕中回，C基因攜帶者的腦功能激活程度高于TT純合子攜帶者。

Tab.1 Comparison of demographic and behavior data between genotypic subgroups表1 不同基因型受試者人口學(xué)及行為學(xué)數(shù)據(jù)的比較

Fig.1 Significant FCD difference found in right occipital gyrus in KIBRA genotypic subgroups圖1 右側(cè)枕中回的FCD存在KIBRA不同基因型間表達(dá)差異

3.1 影像遺傳學(xué)與AD 近年來(lái)，快速發(fā)展的影像遺傳學(xué)將功能影像學(xué)和遺傳學(xué)方法相結(jié)合，將腦功能作為中間表型，相比于單純行為學(xué)評(píng)價(jià)的表型更能直接反映基因功能，為研究基因多態(tài)性對(duì)大腦功能及行為的潛在作用提供了獨(dú)特的視角。FCD是一種不依賴腦圖譜模板來(lái)構(gòu)建腦網(wǎng)絡(luò)的功能影像學(xué)方法，計(jì)算每個(gè)體素與全腦體素存在功能連接的數(shù)目，從全局角度發(fā)現(xiàn)功能連接數(shù)目最多的節(jié)點(diǎn)。該方法不依賴腦圖譜模板來(lái)構(gòu)建腦網(wǎng)絡(luò)，可以更全面、客觀地反映全腦信息，適合對(duì)機(jī)制不明的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病進(jìn)行探索性研究（如AD）。遺傳因素在AD的發(fā)生中起重要作用，且具有不隨時(shí)間病程變化而改變的特點(diǎn)，影像遺傳學(xué)可作為早期識(shí)別AD的一種研究手段。已有研究顯示，AD候選基因KIBRA在AD的重要腦區(qū)海馬和顳葉高表達(dá)，KIBRA基因多態(tài)性與AD危險(xiǎn)存在正相關(guān)。

3.2KIBRA基因多態(tài)性對(duì)行為學(xué)、腦功能的影響 本研究發(fā)現(xiàn)，KIBRATT純合子攜帶者的長(zhǎng)時(shí)記憶好于C基因攜帶者，這里所說(shuō)的長(zhǎng)時(shí)記憶仍屬于短期記憶的范疇，應(yīng)區(qū)別于AD患者長(zhǎng)期記憶保留特點(diǎn)中的長(zhǎng)期記憶概念，TT純合子和C基因攜帶者這兩個(gè)基因型間行為學(xué)的差異可能與KIBRA基因單核苷酸多態(tài)性有關(guān)。KIBRA基因單核苷酸多態(tài)性表現(xiàn)在等位基因T→C堿基轉(zhuǎn)換。正常表達(dá)情況下，KIBRA基因編碼的蛋白位于染色體5q35.1上，包含1 113個(gè)氨基酸，其中第953～996氨基酸區(qū)是與蛋白激酶Cζ（PKCζ）的結(jié)合區(qū)，PKCζ水解形成的異構(gòu)體蛋白激酶M是維持后期長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用（LTP）的必要條件［10-11］。LTP是突觸可塑性的表現(xiàn)形式，而人類記憶的重要神經(jīng)基礎(chǔ)為突觸可塑性。因此，KIBRA對(duì)維持持久性記憶，而且很可能對(duì)維持長(zhǎng)期記憶都是重要的。當(dāng)發(fā)生T→C堿基轉(zhuǎn)換后，影響上述過(guò)程的正常進(jìn)行，推測(cè)可能是C基因攜帶者的長(zhǎng)期記憶存在潛在損傷的原因。無(wú)論是亞洲人群還是歐美人群［1-5］，KIBRAT基因攜帶者在言語(yǔ)記憶、情景記憶、瞬時(shí)記憶及短時(shí)延遲記憶的表現(xiàn)優(yōu)于CC攜帶者，提示C基因型可能影響記憶功能。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，靜息狀態(tài)下長(zhǎng)時(shí)記憶較差的C基因攜帶者的FCD值高于TT純合子攜帶者。對(duì)于KIBRA基因多態(tài)性影響腦功能的研究有多種發(fā)現(xiàn)。一項(xiàng)針對(duì)歐美高加索健康青年人的任務(wù)態(tài)影像遺傳研究發(fā)現(xiàn)，選擇記憶評(píng)分一致的CC基因型和T等位基因攜帶者兩組中，CC攜帶者出現(xiàn)激活腦區(qū)，推測(cè)可能的原因是為了維持同等水平的行為學(xué)功能，出現(xiàn)腦功能的代償激活［1］。而對(duì)歐美高加索老年人的任務(wù)態(tài)研究認(rèn)為，T基因攜帶者記憶評(píng)分較好，同時(shí)發(fā)現(xiàn)腦區(qū)激活增加，是由于該腦區(qū)功能強(qiáng)的原因［3］。對(duì)亞洲青年人群的研究則發(fā)現(xiàn)，C基因攜帶者默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)中的多個(gè)腦區(qū)同步一致性增加，但同時(shí)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的部分腦區(qū)灰質(zhì)體積減小，可能存在腦結(jié)構(gòu)-功能代償［5］。存在以上結(jié)果差異的原因可能有兩點(diǎn)：第一，KIBRA不同基因型的腦功能表現(xiàn)受年齡影響，目前文獻(xiàn)報(bào)道較少，需要更多的研究驗(yàn)證；第二，不同種族人群KIBRA基因型分布不同，例如T等位基因在歐洲高加索人的頻率約為25%，在非裔美國(guó)人群約為50%［1］，而在亞洲人群中卻占到近75%，這也是本研究中將TT純合子作為一組、C等位基因攜帶者作為另一組的依據(jù)。

3.3 枕葉與AD相關(guān)基因關(guān)系 本研究中，KIBRA基因單核苷酸多態(tài)性影響腦功能改變的腦區(qū)是枕中回。AD尸檢神經(jīng)病理結(jié)果顯示，淀粉樣蛋白被認(rèn)為是AD標(biāo)志物，枕葉皮質(zhì)是該淀粉樣蛋白早期出現(xiàn)的腦區(qū)之一［12］。影像學(xué)上有相關(guān)的研究證實(shí)，AD患者枕葉具有結(jié)構(gòu)、靜息態(tài)和任務(wù)態(tài)功能及功能網(wǎng)絡(luò)的損傷。例如，AD患者的枕葉灰質(zhì)體積減少，且與大腦靜息狀態(tài)默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)的功能連接減低有關(guān)［13］。另一項(xiàng)早期AD患者的腦網(wǎng)絡(luò)與任務(wù)表現(xiàn)有效性關(guān)系的研究顯示，表現(xiàn)有效性高的AD患者在顳枕葉腦區(qū)出現(xiàn)了增強(qiáng)的腦功能連接度，而這種增強(qiáng)的表現(xiàn)被認(rèn)為是一種對(duì)神經(jīng)退變的代償機(jī)制［14］。另外，枕葉的靜息狀態(tài)出現(xiàn)α節(jié)律被認(rèn)為是輕度認(rèn)知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）的重要腦電圖（electroencephalographic，EEG）標(biāo)志，早期AD的認(rèn)知功能和灰質(zhì)密度與枕葉的α節(jié)律的幅度呈正相關(guān)［15］。正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像（PET-CT）研究發(fā)現(xiàn)，為了維持較好的定向能力，AD患者的枕中回代謝增加［16］。更進(jìn)一步研究顯示，在AD的早期階段MCI患者中，攜帶載脂蛋白E（ApoE）ε4基因的MCI-AD轉(zhuǎn)歸者具有更顯著的枕葉萎縮，而非ApoEε4基因的MCI-AD轉(zhuǎn)歸者僅有額頂葉體積的減少［17］。以上研究提示，在AD的早期及晚期階段均有枕葉的受累，表現(xiàn)為體積的減少及功能的減退。ApoEε4基因能增加晚發(fā)型AD的風(fēng)險(xiǎn)或年齡相關(guān)的認(rèn)知功能減退，該基因被認(rèn)為是AD的風(fēng)險(xiǎn)基因。一項(xiàng)研究納入了26～45歲的正常中青年人群，通過(guò)比較攜帶ApoEε4基因與非攜帶者的腦灰質(zhì)體積發(fā)現(xiàn)，攜帶ApoEε4基因人群的枕葉皮質(zhì)灰質(zhì)體積相對(duì)增加［18］。且本研究發(fā)現(xiàn)KIBRAC基因攜帶者的FCD增高。這些研究反映了在AD發(fā)生之前，長(zhǎng)期存在的基因差異可持續(xù)性地影響腦結(jié)構(gòu)和功能，這些結(jié)構(gòu)和功能的改變可能會(huì)最終導(dǎo)致AD候選基因攜帶者在步入老年時(shí)易患AD。

3.4 局限性及展望 本研究存在一定的局限性。首先，雖然入組人數(shù)已達(dá)到近300例，但是對(duì)于影像遺傳研究來(lái)說(shuō)，單個(gè)等位基因的樣本量仍顯不足；最終入組的受試者主要是天津地區(qū)的漢族大學(xué)生人群，在不同地區(qū)、種族間有無(wú)差異需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并驗(yàn)證當(dāng)前研究的結(jié)果。其次，KIBRA基因?yàn)锳D候選基因，因此下一步的研究對(duì)象將擴(kuò)展為老年人及AD患者。最后，本研究結(jié)果顯示KIBRA不同基因型間只有右側(cè)枕中回的FCD存在差異，其原因未明，我們會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并驗(yàn)證左、右兩側(cè)枕中回FCD的差異。

綜上，本研究探討了天津地區(qū)健康漢族青年人群KIBRA基因多態(tài)性對(duì)認(rèn)知及腦功能的影響，有助于發(fā)現(xiàn)AD遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素造成記憶功能損害的神經(jīng)機(jī)制，為建立早期識(shí)別AD風(fēng)險(xiǎn)人群的遺傳及影像學(xué)指標(biāo)奠定基礎(chǔ)。

［1］Papassotiropoulos A，Stephan DA，Huentelman MJ，et al.Common Kibra alleles are associated with human memory performance［J］.Science，2006，314（5798）：475-478.doi：10.1126/science.1129837.

［2］Yasuda Y，Hashimoto R，Ohi K，et al.Association study of KIBRA gene with memory performance in a Japanese population［J］.World J Biol Psychiatry，2010，11（7）：852-857.doi：10.3109/15622971003797258.

［3］Kauppi K，Nilsson LG，Adolfsson R，et al.KIBRA polymorphism is related to enhanced memory and elevated hippocampal processing［J］.J Neurosci，2011，31（40）：14218-14222.doi：10.1523/JNEUROSCI.3292-11.2011.

［4］Witte AV，K?be T，Kerti L，et al.Impact of KIBRA polymorphism on memory function and the hippocampus in older adults［J］.Neuropsychopharmacology，2016，41（3）：781-790.doi：10.1038/npp.2015.203.

［5］Wangd，Liu B，Qin W，et al.KIBRA gene variants are associated with synchronization within the default-mode and executive control networks［J］.Neuroimage，2013，69：213-222.doi：10.1016/j.neuroimage.2012.12.022.

［6］Werschingh，Guske K，Hasenkamp S，et al.Impact of common KIBRA allele on human cognitive functions ［J］.Neuropsychopharmacology，2011，36（6）：1296-1304.doi：10.1038/npp.2011.16.

［7］Burgess JD，Pedraza O，Graff-Radford NR，et al.Association of common KIBRA variants with episodic memory and AD risk［J］.Neurobiol Aging，2011，32（3）：557.e1-9.doi：10.1016/j.neurobiolaging.2010.11.004.

［8］Sédille-Mostafaie N，Sebesta C，Huber KR，et al.The role of memory-related gene polymorphisms，KIBRA and CLSTN2，on replicate memory assessment in the elderly［J］.J Neural Transm（Vienna），2012，119（1）：77-80.doi：10.1007/s00702-011-0667-9.

［9］Zhang N，Liuh，Qin W，et al.APOE and KIBRA interactions on brain functional connectivity in healthy young adults［J］.Cereb Cortex，2017，27（10）：4797-4805.doi：10.1093/cercor/bhw276.

［10］Tracy TE，Sohn PD，Minami SS，et al.Acetylated tau obstructs KIBRA-mediated signaling in synaptic plasticity and promotes tauopathy-related memory loss［J］.Neuron，2016，90（2）：245-260.doi：10.1016/j.neuron.2016.03.005.

［11］吳靜，楊睿，劉樹業(yè).蛋白激酶C抑制劑的研究新進(jìn)展［J］.天津醫(yī)藥，2016，44（1）：114-117.Wu J，Yang R，Liu SY，et al.New progress in the study of protein kinase C（PKC）inhibitors［J］.Tianjin Med J，2016，44（1）：114-117.doi：10.11958/20150079.

［12］Braakh，Braak E.Neuropathological stageing of Alzheimerrelated changes［J］.Acta Neuropathol，1991，82（4）：239-259.

［13］Hafkemeijer A，M?ller C，Dopper EG，et al.Resting state functional connectivity differences between behavioral variant frontotemporal dementia and Alzheimer’s disease［J］.Front Hum Neurosci，2015，9：474.doi：10.3389/fnhum.2015.00474.

［14］De Marco M，Duzzid，Meneghello F，et al.Cognitive efficiency in Alzheimer’sdisease isassociated with increased occipital connectivity［J］.J Alzheimers Dis，2017，57（2）：541-556.doi：10.3233/JAD-161164.

［15］Babiloni C，Del Percio C，Boccardi M，et al.Occipital sources of resting-state alpha rhythms are related to local gray matter density in subjects with amnesic mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease［J］.Neurobiol Aging，2015，36（2）：556-570.doi：10.1016/j.neurobiolaging.2014.09.011.

［16］Weissberger GH，Melrose RJ，F(xiàn)anale CM，et al.Cortical metabolic and cognitive correlates of disorientation in Alzheimer’s disease［J］.J Alzheimers Dis，2017，60（2）：707-719.doi：10.3233/JAD-170420.

［17］Morgen K，F(xiàn)r?lich L，Tosth，et al.APOE-dependent phenotypes in subjects with mild cognitive impairment converting to Alzheimer’s disease［J］.J Alzheimers Dis，2013，37（2）：389-401.doi：10.3233/JAD-130326.

［18］Alexander GE，Bergfield KL，Chen K，et al.Gray matter network associated with risk for Alzheimer’s disease in young to middleaged adults［J］.Neurobiol Aging，2012，33（12）：2723-2732.doi：10.1016/j.neurobiolaging.2012.01.014.