黃寧，于洋

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器之一，與細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白及膜蛋白的合成折疊、脂質(zhì)代謝、甾體激素合成密切相關(guān)，同時(shí)作為鈣離子貯存庫(kù)，發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)維持的重要作用［1-3］。一些生理或病理情況，如低氧［4］、能量不足［5］、鈣離子濃度異常［6］以及游離脂肪酸含量過(guò)多［7］均會(huì)干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，導(dǎo)致大量未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為了減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷，細(xì)胞激活未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答（UPR）可維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞存活。UPR通過(guò)激活三條經(jīng)典通路——PERK通路、IRE1α通路、ATF6通路，將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)折疊異常的信號(hào)傳遞至細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)乃至整個(gè)細(xì)胞，通過(guò)減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)流入負(fù)擔(dān)，增強(qiáng)蛋白質(zhì)折疊能力，誘導(dǎo)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解，從而促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)［8］。

目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與卵巢生理功能及疾病發(fā)病密切相關(guān)，但是其具體的分子途徑尚不清楚。卵泡的生長(zhǎng)主要表現(xiàn)為卵母細(xì)胞體積的增長(zhǎng)及顆粒細(xì)胞的增殖。顆粒細(xì)胞的快速增殖需要大量蛋白質(zhì)的支持，同時(shí)可能會(huì)造成局部的缺氧環(huán)境，從而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能異常，導(dǎo)致大量未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR［9-10］。本研究旨在探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在體內(nèi)環(huán)境中對(duì)卵巢生理功能的調(diào)節(jié)作用，利用經(jīng)典內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)物衣霉素經(jīng)腹腔注射建立小鼠卵巢內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，通過(guò)與對(duì)照組比較UPR標(biāo)志分子的表達(dá)差異，明確小鼠卵巢內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為10只C57品系雌性小鼠。所有小鼠均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，均為SPF級(jí)。實(shí)驗(yàn)中所使用動(dòng)物的操作流程均經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。所有小鼠飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度（23±2）℃，相對(duì)濕度為（55±10）%，SPF環(huán)境，光照時(shí)間為12h光照/12h黑暗，自由攝食飲水。動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組4只，實(shí)驗(yàn)組6只。對(duì)照組每只小鼠腹腔注射150 mmol/L葡萄糖溶液溶解的二甲基亞砜（DMSO），而實(shí)驗(yàn)組每只小鼠注射150 mmol/L葡萄糖溶液溶解的衣霉素。分別于0、24、48h各注射1次藥物，第3次注射后4h處死小鼠，收集小鼠卵巢。

1.2 HE染色 將收集的小鼠卵巢立即放入4%的多聚甲醛固定過(guò)夜，石蠟包埋切片。二甲苯脫蠟，100%、95%、90%、80%及70%的乙醇由高到低至切片入水。將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘。切片放入自來(lái)水中洗去多余的蘇木精染料。70%乙醇配制的0.5%～1%鹽酸對(duì)切片分色數(shù)秒到數(shù)十秒。放入0.5%～1%氨水中30～60 s藍(lán)化。0.5%～1%伊紅染料染色2～3 min。100%、95%、90%、80%及70%的乙醇從低到高脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明，樹(shù)膠封片。

1.3 RNA的提取及RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 采用Quick-RNA MiniPrep kit（ZYMO Research）試劑盒提取組織 RNA，使用NanoDrop分光光度計(jì)檢測(cè)提取的RNA的濃度和純度。取1 μg RNA使用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific）試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR實(shí)驗(yàn)采用7500 Real-Time PCR儀（Applied Biosystems）完成。以β-actin為內(nèi)參照，引物序列見(jiàn)表1。體系為：1 μL cDNA樣品，各 1 μL 上下游引物，7 μL 水，10 μL SYBR green mix（Applied Biosystems）。反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 2 min；40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。采用2-ΔΔCT法分析結(jié)果。

Tab.1 The primer sequences used for real-time quantitative PCR表1 實(shí)時(shí)定量PCR中使用的引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠卵巢內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型的建立 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠卵巢內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子HSPA5、CHOP、ATF4mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Expression of ER stress related genes表2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)情況

2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)小鼠卵巢卵泡發(fā)育的影響 對(duì)照組小鼠卵巢中可以看到各期發(fā)育的卵泡，在衣霉素處理后，小鼠卵巢中卵泡數(shù)量明顯減少，只有少數(shù)極小的卵泡，見(jiàn)圖1。

Fig.1 HE staining showing ovaries of mice（×40）圖1 HE染色檢測(cè)小鼠卵巢變化（×40）

3 討論

卵巢是一個(gè)長(zhǎng)期處在動(dòng)態(tài)變化中的器官。成年人的卵巢，無(wú)論是其結(jié)構(gòu)還是功能，都存在周期性變化的特征。卵巢既具有產(chǎn)生卵母細(xì)胞和維持卵母細(xì)胞分裂生長(zhǎng)的生殖作用，也具有分泌性激素的內(nèi)分泌功能，而卵泡是執(zhí)行卵巢生殖和內(nèi)分泌功能的基本單位，卵泡的質(zhì)量和數(shù)量決定著生殖潛能和生殖周期。卵泡主要包括了最內(nèi)層的卵母細(xì)胞、包裹卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞以及卵泡最外層的膜細(xì)胞，其發(fā)育經(jīng)歷了4個(gè)過(guò)程：即始基卵泡、次級(jí)卵泡、竇前卵泡及排卵前卵泡［11］。在卵泡發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中，只有有限的卵泡（大約300～400個(gè)或者整體的1%）發(fā)育成熟并進(jìn)行排卵，大多數(shù)卵泡在發(fā)育的各個(gè)階段逐漸退化，發(fā)生卵泡閉鎖。大量研究已經(jīng)明確了下丘腦-垂體-卵巢軸在卵泡閉鎖中的重要作用［12］，但對(duì)于卵巢局部微環(huán)境及卵泡內(nèi)生殖細(xì)胞體細(xì)胞對(duì)卵泡閉鎖的影響尚未完全闡明。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)激活的UPR是一個(gè)集適應(yīng)性應(yīng)答和凋亡性應(yīng)答于一體的雙重反應(yīng)途徑，輕度或短暫的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)激活三條經(jīng)典通路改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊能力，促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)激活時(shí)，UPR會(huì)誘導(dǎo)激活下游凋亡通路，促使細(xì)胞凋亡以避免對(duì)整個(gè)器官的損害［13］。UPR對(duì)于改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，但過(guò)度激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激造成UPR凋亡途徑的啟動(dòng)被認(rèn)為參與了多種疾病的發(fā)生。

目前已有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活會(huì)促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，顆粒細(xì)胞可能參與卵泡閉鎖過(guò)程［14］。顆粒細(xì)胞是卵泡的主要細(xì)胞成分，不僅對(duì)維持卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，也是性激素合成的主要場(chǎng)所。研究發(fā)現(xiàn)，在卵泡閉鎖的早期階段，凋亡主要發(fā)生在顆粒細(xì)胞層，而非卵母細(xì)胞或膜細(xì)胞層，因此顆粒細(xì)胞被視為卵泡閉鎖的啟動(dòng)者［15］。有實(shí)驗(yàn)在羊卵巢各級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞中檢測(cè)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在羊卵巢的閉鎖卵泡和未閉鎖卵泡的顆粒細(xì)胞中均檢測(cè)到了UPR標(biāo)志分子GRP78（HSPA5）的表達(dá)，而UPR中與凋亡密切相關(guān)的CHOP分子的表達(dá)僅在閉鎖卵泡的顆粒細(xì)胞中檢測(cè)到，未閉鎖卵泡中并沒(méi)有檢測(cè)到；另外，閉鎖卵泡中GRP78和CHOP的分布與閉鎖卵泡中凋亡的顆粒細(xì)胞分布一致，均位于閉鎖卵泡卵泡腔側(cè)顆粒細(xì)胞［14］。也有研究利用體外實(shí)驗(yàn)探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)顆粒細(xì)胞的影響，通過(guò)加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)物衣霉素或加入無(wú)血清培養(yǎng)液模擬營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致了顆粒細(xì)胞凋亡［14］，這進(jìn)一步驗(yàn)證了UPR在調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡中的重要作用。在已建立的小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型中，本研究結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，衣霉素處理后的小鼠卵巢各期卵泡數(shù)均明顯減少，說(shuō)明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激明顯抑制了小鼠卵巢卵泡的發(fā)育。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活凋亡反應(yīng)途徑促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡的作用有關(guān)，而顆粒細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致卵泡閉鎖的重要因素。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是甾體激素合成的重要場(chǎng)所，雌、孕、雄激素的合成依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的精密配合，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活會(huì)造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，不僅會(huì)破壞激素合成的局部環(huán)境，也可能干擾激素合成相關(guān)酶的表達(dá)，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激很可能影響了性激素合成水平，從而影響了卵泡發(fā)育。

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