雷蕾，黃珊，于明航，劉志強(qiáng)，劉師偉，李婷，趙秀娟，李澤興△，王璽△

自噬是真核生物的應(yīng)激調(diào)控機(jī)制，通過(guò)循環(huán)利用細(xì)胞自身的一些細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等生物大分子來(lái)滿足細(xì)胞的代謝更新和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持。上世紀(jì)60年代，科學(xué)家通過(guò)電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)了自噬的存在，確認(rèn)自噬是細(xì)胞的“自食”現(xiàn)象。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）通過(guò)剪切修飾定位于自噬體膜上，成為指示自噬的標(biāo)志蛋白［1-2］。人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞（THP-1）是從急性單核細(xì)胞性白血病患者外周血中分離建立的細(xì)胞系［3］，是體外研究單核-巨噬細(xì)胞分化、免疫功能和信號(hào)通路機(jī)制等常用的細(xì)胞系［4-5］。為了更直觀地檢測(cè)單核-巨噬細(xì)胞中的自噬現(xiàn)象，本研究通過(guò)慢病毒質(zhì)粒系統(tǒng)使THP-1細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3融合蛋白，為在單核-巨噬細(xì)胞中深入研究自噬提供可靠的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒 THP-1細(xì)胞、293T細(xì)胞為天津醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系發(fā)育與腫瘤發(fā)生表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；pCDH-CMV-MCS-EF1α-puro、pAS-TMX、pMD-1G質(zhì)粒由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所孫欽秒研究員惠贈(zèng)；pCDH-CMV-GFPLC3-EF1α-puro由本實(shí)驗(yàn)室按標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素購(gòu)自天津市中奧天元科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自烏拉圭Lonsera公司；胰蛋白酶和Opti-MEM I減血清培養(yǎng)基購(gòu)自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；嘌呤霉素（Puromycin）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；Earle’s平衡鹽溶液（EBSS）購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；雷帕霉素（Rapamycin）購(gòu)自美國(guó)LC Laboratories公司；聚乙烯亞胺（PEI）溶液由Milli Q水配制成1 g/L（pH=7.2）儲(chǔ)存液；聚凝胺（polybrene）溶液由Milli Q水配制成1 g/L儲(chǔ)存液；佛波酯（PMA）購(gòu)自Sigma公司，由DMSO配制成2.5 g/L儲(chǔ)存液；細(xì)胞裂解液［0.5%Triton X-100，50 mmol/L Tris-HCl，pH=7.2，150 mmol/L NaCl，10%Glycerol，10 mmol/L MgCl2，蛋白酶抑制劑（100 mmol/L PMSF；100 mg/L Aprotinin）］；Western blot ECL發(fā)光液（德國(guó)默克公司）；LSRFortessa流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；AI 600系列超靈敏多功能成像儀（美國(guó)GE公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；倒置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.3 抗體 鼠抗GFP單克隆抗體、鼠抗α-Tubulin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（天津三箭生物技術(shù)股份有限公司），兔抗LC3A/B抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鼠抗IgG抗體（CST公司）。

1.4 穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的THP-1細(xì)胞系的建立

1.4.1 PEI轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒 轉(zhuǎn)染前1d對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，將4×106個(gè)細(xì)胞接種于直徑為100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中；第2天，取1 mL Opti-MEM置于1.5 mL EP管中，加入20 μL PEI后輕輕震蕩混勻，加入20 μg DNA（10 μg pCDHCMV-GFP-LC3-EF1α -puro，5 μg pAS-TMX，5 μg pMD-1G），輕輕震蕩混勻，室溫靜置5 min；將DNA-PEI混合物逐滴加入293T細(xì)胞中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿使沉淀分散均勻，正常培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染8h后將293T細(xì)胞DMEM培養(yǎng)基更換為5 mL RPMI 1640培養(yǎng)基。

1.4.2 慢病毒感染THP-1細(xì)胞系 轉(zhuǎn)染48h后收集293T細(xì)胞及培養(yǎng)基，2 000 r/min離心5 min取上清，使用0.45 μm濾器過(guò)濾，加入polybrene使其終濃度為8 mg/L；將THP-1細(xì)胞離心后去掉正常培養(yǎng)基，使用上述配制好的病毒液重懸細(xì)胞，感染12h后更換正常RPMI 1640培養(yǎng)基。

1.4.3 Puromycin篩選穩(wěn)定細(xì)胞株 病毒感染48h后，換為Puromycin終濃度為0.1 mg/L的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，每3d更換1次含Puromycin的RMPI 1640培養(yǎng)基，同時(shí)以未感染病毒的THP-1細(xì)胞作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)6d后，陰性對(duì)照組細(xì)胞全部死亡，病毒感染組細(xì)胞正常生長(zhǎng)，熒光顯微鏡觀察感染的THP-1細(xì)胞表達(dá)GFP蛋白。

1.5 穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3蛋白THP-1細(xì)胞系的鑒定

1.5.1 倒置熒光顯微鏡觀察THP-1細(xì)胞中GFP-LC3蛋白的表達(dá) 倒置熒光顯微鏡觀察培養(yǎng)皿中表達(dá)GFP-LC3蛋白的THP-1細(xì)胞，鏡下任意選取視野，分別于明暗視野觀察細(xì)胞，檢測(cè)綠色GFP蛋白表達(dá)的高低。

1.5.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THP-1細(xì)胞中GFP-LC3蛋白的表達(dá) 將表達(dá)GFP-LC3的感染組THP-1細(xì)胞和未感染組THP-1細(xì)胞，分別制備成1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液；取0.5 mL用流式細(xì)胞儀488 nm激光器激發(fā)，F(xiàn)ITC熒光通道收集熒光信號(hào)，獲取5 000個(gè)細(xì)胞，以未感染組THP-1細(xì)胞作陰性對(duì)照，分析GFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分率和平均熒光強(qiáng)度。

1.5.3 Western blot檢測(cè)THP-1細(xì)胞中GFP-LC3蛋白的表達(dá) 分別收集5×106個(gè)感染組THP-1細(xì)胞和未感染組THP-1細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，去掉培養(yǎng)基后，使用1 mL PBS洗滌1次；加入適量細(xì)胞裂解液，超聲破碎后，將總蛋白煮沸5 min使其變性；取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，并電轉(zhuǎn)移至NC膜，5%脫脂奶粉/TBST室溫封閉1h，加入一定比例稀釋的一抗（GFP 1∶500，LC3A/B 1∶1 000，α-Tubulin 1∶5 000），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次后，分別加入HRP標(biāo)記的IgG二抗（鼠抗HRP 1∶4 000，羊抗兔HRP 1∶2 000），室溫孵育1h，TBST洗膜3次，加入ECL液暗室孵育適當(dāng)時(shí)間，利用GE AI 600系列超靈敏多功能成像儀進(jìn)行顯色，Image J軟件進(jìn)行分析。

1.6 饑餓及藥物誘導(dǎo)THP-1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的自噬發(fā)生

1.6.1 激光共聚焦法觀察饑餓和藥物誘導(dǎo)細(xì)胞自噬體的形成 對(duì)獲得的穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的THP-1細(xì)胞，按1×105個(gè)/孔接種于預(yù)置爬片的12孔板中，生長(zhǎng)24h后將其分為3組。（1）正常對(duì)照組：正常培養(yǎng)基中加入100 μg/L PMA，培養(yǎng)7h。（2）饑餓處理組：EBSS溶液培養(yǎng)同時(shí)加入100 μg/L PMA孵育7h。（3）藥物處理組：正常培養(yǎng)基中加入500 nmol/L雷帕霉素和100 μg/L PMA共同孵育7h。以上3組處理結(jié)束后，用1×PBS洗滌細(xì)胞，之后用4%甲醛/PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，使用激光共聚焦顯微鏡觀察3組細(xì)胞，各組隨機(jī)取10個(gè)視野，觀察GFP蛋白的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成。

1.6.2 Western blot檢測(cè)饑餓和藥物誘導(dǎo)自噬的形成 對(duì)獲得的穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3蛋白的THP-1細(xì)胞，按1×106個(gè)/孔接種于6孔板中，生長(zhǎng)24h后將其分為3組。（1）正常對(duì)照組：正常培養(yǎng)基中加入100 μg/L PMA培養(yǎng)12h。（2）饑餓處理組：EBSS溶液培養(yǎng)同時(shí)加入100 μg/L PMA共同孵育12h。（3）藥物處理組：正常培養(yǎng)基中加入500 nmol/L雷帕霉素和100 μg/L PMA共同孵育12h。分別收集3組細(xì)胞，按1.5.3方法進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)自噬的形成。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3蛋白的THP-1細(xì)胞系鑒定結(jié)果

2.1.1 倒置熒光顯微鏡觀察的結(jié)果 倒置熒光顯微鏡下觀察穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3蛋白的THP-1細(xì)胞，可看到GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較多，且呈懸浮狀態(tài)，見圖1。

Fig.1 Expression of GFP in THP-1 cells observed by fluorescent microscope(×20)圖1 熒光顯微鏡下觀察GFP蛋白在THP-1細(xì)胞中的表達(dá)（×20）

2.1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，以未感染組THP-1細(xì)胞為陰性對(duì)照，感染組THP-1細(xì)胞GFP陽(yáng)性百分比高達(dá)92.7%，見圖2。

Fig.2 The expression levels of GFP in THP-1 cells detected by FACS圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THP-1細(xì)胞中的GFP的表達(dá)效率

2.1.3 Western blot檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示，未感染組中僅可以檢測(cè)到內(nèi)源LC3蛋白（Ⅰ型-16 ku；Ⅱ型-14 ku）；感染組除了內(nèi)源性LC3有表達(dá)，在45 ku附近也有GFP-LC3融合蛋白表達(dá)，其表達(dá)量與設(shè)計(jì)一致，見圖3。

2.2 饑餓及藥物誘導(dǎo)自噬體形成的結(jié)果

2.2.1 激光共聚焦法觀察結(jié)果 激光共聚焦顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組的綠色熒光在細(xì)胞中呈散在分布；饑餓處理組和藥物處理組誘導(dǎo)自噬后，多數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)綠色熒光點(diǎn)狀聚集的自噬體，見圖4。

2.2.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果 正常對(duì)照組中的GFP-LC3蛋白在45 ku附近為單一條帶；饑餓處理組和藥物處理組中，GFP-LC3融合蛋白發(fā)生剪切，從GFP-LC3-Ⅰ型向GFP-LC3-Ⅱ型轉(zhuǎn)化，蛋白的分子質(zhì)量變小。Western blot灰度分析顯示，與正常對(duì)照組相比，饑餓處理組和藥物處理組GFP-LC3融合蛋白從Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)化明顯增加（P＜0.05）。見圖5。

Fig.3 The expression of GFP-LC3 and LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱin THP-1 cells圖3 THP-1細(xì)胞感染后GFP-LC3和內(nèi)源LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)結(jié)果

Fig.4 Aggregates of GFP-LC3 in THP-1 cell line observed by confocal microscope(×60)圖4 激光共聚焦顯微鏡觀察THP-1穩(wěn)定細(xì)胞系中GFP-LC3的聚集（×60）

Fig.5 Expression of GFP-LC3-Ⅱ/Ⅰin the EBSS-or rapamycintreated THP-1 cells圖5 饑餓及藥物處理GFP-LC3-THP-1細(xì)胞后GFP-LC3-Ⅰ型蛋白向GFP-LC3-Ⅱ型蛋白轉(zhuǎn)化的表達(dá)結(jié)果

3 討論

3.1 自噬在臨床疾病中的研究進(jìn)展 近年的研究表明，自噬和許多疾病的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。自噬可通過(guò)與先天免疫信號(hào)共同調(diào)節(jié)炎癥［6-7］。自噬相關(guān)基因通過(guò)調(diào)控腫瘤微環(huán)境，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)與增殖產(chǎn)生雙重調(diào)節(jié)作用，為發(fā)現(xiàn)腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)提供了新思路［8］。另外，在阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病中，通過(guò)自噬來(lái)控制蛋白質(zhì)質(zhì)量是神經(jīng)元存活和功能的重要保證，一旦自噬功能缺失，神經(jīng)元中錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)或受損細(xì)胞器不斷累積，這就可能成為各種神經(jīng)退行性疾病發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)［9］。

3.2 自噬的誘導(dǎo)及檢測(cè)方法 通過(guò)電鏡檢測(cè)自噬體及其相關(guān)結(jié)構(gòu)是檢測(cè)自噬的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于電鏡操作及數(shù)據(jù)分析專業(yè)性要求較高，目前的文獻(xiàn)報(bào)道中最常用的方法有Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅰ（16 ku）與LC3-Ⅱ（14 ku）之間的轉(zhuǎn)化和比例變化，以及通過(guò)熒光顯微鏡觀察LC3點(diǎn)狀聚集物的形成［10-12］，這些方法都可以監(jiān)測(cè)自噬發(fā)生的程度。2006年首次報(bào)道了雷帕霉素機(jī)制性靶標(biāo)（the mechanistic target of rapamycin，mTOR）與自噬的關(guān)系，并證實(shí)抑制mTOR可以提高自噬水平［13-14］，由此利用雷帕霉素誘導(dǎo)自噬成為經(jīng)典模型之一。饑餓狀態(tài)下細(xì)胞也可以通過(guò)調(diào)控AMPK、mTOR等信號(hào)通路來(lái)提高自噬水平，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)組分加快降解循環(huán)以維持細(xì)胞正常生存［15］?；谝陨戏椒z測(cè)穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3蛋白的THP-1細(xì)胞系，操作簡(jiǎn)便，自噬現(xiàn)象易于觀察，證實(shí)此細(xì)胞系可作為判斷自噬水平的一種細(xì)胞模型。

3.3 本研究的意義 慢病毒感染相較其他轉(zhuǎn)染方法使THP-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率更高［16］，由此利用慢病毒質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3蛋白的THP-1細(xì)胞系，此細(xì)胞系在誘導(dǎo)自噬的條件下，融合蛋白GFP-LC3隨著自噬體的形成發(fā)生聚集，通過(guò)觀察GFP-LC3融合蛋白的變化，反映出內(nèi)源性LC3的類型轉(zhuǎn)化。因此，穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3蛋白的THP-1細(xì)胞系為進(jìn)一步探討單核-巨噬細(xì)胞的自噬機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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