劉 雙 潘桂海 史建強 周 飛 林加西 陽慧芝 吳志華 陳嶸祎

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種自身免疫性疾病，目前仍然主要使用糖皮質(zhì)激素(GC)治療。而約30% SLE患者因此誘發(fā)糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(Glucoeorticoid induced osteoporosis，GIOP)[1]。目前GIOP居繼發(fā)性骨質(zhì)疏松病因的第一位，較原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥更易發(fā)生骨折或股骨頭缺血壞死，甚至殘疾[2]。本課題組既往采用仙珍骨康膠囊防治SLE患者GIOP取得確切的療效，證明了中醫(yī)補腎健脾法組方結(jié)合糖皮質(zhì)激素治療SLE能產(chǎn)生良好的協(xié)同效應來防治GIOP[3]。然而SLE合并GIOP的病因較復雜，為避免因患者病情、病程、糖皮質(zhì)激素劑量、遺傳背景等差異對藥物的療效造成統(tǒng)計學上的偏倚，為探討仙珍骨康膠囊防治GIOP的分子機制，本研究通過建立小鼠地塞米松骨質(zhì)疏松模型，并對關(guān)鍵療效指標進行實時量效研究，以探討仙珍骨康膠囊防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與儀器 5周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠40只,體質(zhì)量15～17 g,均由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供,喂食普通顆粒飼料,室溫20℃左右,自然光照,保持良好通風,自由進水進食。主要儀器:多模式活體成像系統(tǒng)(德國BRUKER，型號In-VivoXtreme),透射電鏡(日本JEM-1400型透射電子顯微鏡)。

1.2 主要藥物和試劑 地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司,國藥準字H12020515),仙珍骨康膠囊(由廣東醫(yī)科大學天然藥物開發(fā)公司提供,中國專利號:201410412279.4,批準文號:粵藥制字Z20070673)。仙珍骨康膠囊是由淫羊藿、蛇床子和珍珠層粉組成的中藥復方制劑。具有溫腎壯陽、強筋骨、袪風濕等功能，適用于陽萎遺精、筋骨痿軟、風濕痹痛、麻木拘攣、婦女宮冷、寒濕帶下和中老年人骨質(zhì)疏松癥等。I型前膠原C-端肽(PICP) 、骨鈣素(BGP)、骨堿性磷酸酶(BALP)、雌二醇(E2)、降鈣素(CT)、甲狀旁腺激素(PTH)、孕酮(PRG)ELISA試劑盒(上海研輝生物科技有限公司), 血鈣、血磷測試盒(上海合雨生物科技有限公司), Trizol(life technologies)。

1.3 分組與造模方法 將40只C57BL/6小鼠按隨機分組設計原則，分為地塞米松組(A組)、仙珍骨康組(B組)、地塞米松+仙珍骨康組(C組)和對照組(D組)，每組10只。地塞米松組小鼠按1 mg/kg的劑量，每周2次臀肌注射地塞米松磷酸鈉；仙珍骨康組以仙珍骨康混懸液22 mL/kg灌胃，每日1次；地塞米松+仙珍骨康組小鼠按1 mg/kg的劑量，每周2次臀肌注射地塞米松磷酸鈉并以仙珍骨康混懸液22 mL/kg灌胃，每日1次；對照組正常飼養(yǎng)，不做處理。實驗6周后處死全部老鼠。

1.4 指標檢測

1.4.1 骨密度測定 處死前，給予小鼠腹腔注射10%水合氯醛4 mL/kg麻醉，當小鼠呈穩(wěn)定的昏睡狀態(tài)達到5 min以上時，利用多模式活體成像系統(tǒng)對脊柱及雙側(cè)股骨近端進行X線攝片，利用自帶軟件進行雙側(cè)股骨近端及L2骨密度測定。

1.4.2 透射電鏡觀察 取右側(cè)股骨的下1/3段，使用銳利器械從其冠狀面剖成兩半，3%的戊二醛固定24 h后，然后以5%的硝酸脫鈣1周，送交電鏡室行常規(guī)超薄切片、電鏡觀察。

1.4.3 血液學檢測 采用10%水合氯醛將小鼠麻醉后，采用摘除眼球的方法取血，提取血清后，置于-20℃冰箱內(nèi)保存。按試劑盒說明書上的方法，分別測定血清甲狀旁腺激素(PTH)、I型前膠原C-端肽(PICP)、骨鈣素(BGP)、骨堿性磷酸酶(BALP)、雌二醇(E2)、孕酮(PRG)、降鈣素(CT)、血鈣、血磷的含量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠骨密度測定結(jié)果 地塞米松組股骨近端及L2的骨密度最低(P<0.01)，仙珍骨康組、地塞米松+仙珍骨康組與對照組股骨近端骨密度的差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見圖1、表1。

2.2 透射電鏡觀察各組小鼠成骨細胞形態(tài) 地塞米松組見成骨細胞溶解，形態(tài)變長；仙珍骨康組見成骨細胞結(jié)構(gòu)正常, 細胞核染色質(zhì)分布均勻；地塞米松+仙珍骨康組見成骨細胞核為卵圓形，有膠原分泌；正常對照組成骨細胞可見有較多膠原分泌, 細胞中存在大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體(圖2)。

2.3 各組小鼠各項血液指標的結(jié)果 仙珍骨康組PTH水平最高，地塞米松+仙珍骨康組次之，其次為對照組，地塞米松組最低(P<0.0001)；仙珍骨康組PICP、BALP水平最高，其次為地塞米松+仙珍骨康組與對照組，地塞米松組最低(P<0.0001)；地塞米松組BGP、E2水平最高，其次為地塞米松+仙珍骨康組和對照組，仙珍骨康組最低(P<0.0001)；仙珍骨康組PROG水平最低，其次為地塞米松+仙珍骨康組與對照組，地塞米松組最高(P<0.0001)；地塞米松組CT水平最高，對照組次之，其次為地塞米松+仙珍骨康組，仙珍骨康組最低(P<0.0001)；各組血鈣及Pi水平的差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。

圖1 德國BRUKER多模式活體成像系統(tǒng)檢測各組小鼠股骨近端及L2的骨密度

圖2 透射電鏡觀察各組小鼠成骨細胞形態(tài)

表1 各組小鼠股骨近端及L2椎體骨密度比較

表2 各組小鼠觀察血液指標的檢測結(jié)果

3 討論

目前GIOP居繼發(fā)性骨質(zhì)疏松病因的第一位，嚴重影響患者生活質(zhì)量，增加家庭及社會的負擔，如何防治SLE合并GIOP已成臨床亟待解決的難題。采用仙珍骨康膠囊防治SLE患者GIOP的確切療效，不僅證明了復方中藥制劑可有效防治GIOP，而且在GIOP發(fā)病機制的研究上取得了可喜的進展[4,5]。本課題根據(jù)“腎主骨”的中醫(yī)學理論，腎虛是骨質(zhì)疏松的發(fā)病關(guān)鍵，若腎精充足，則筋骨堅硬有力；腎虛則骨弱無力，故治療宜補腎壯骨；脾虛則后天化源不足，五臟失養(yǎng)，則導致腎精虧虛，骨骼失養(yǎng)，骨骼脆弱無力，最終致發(fā)生骨質(zhì)疏松癥[6]。故宜用補腎壯骨、益氣健脾的治療法則[7，8]。本課題構(gòu)建了糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松動物模型從骨結(jié)構(gòu)、動態(tài)、準確地觀測骨質(zhì)疏松療效指標的變化，為仙珍骨康膠囊的應用提供更重要的實驗依據(jù)，并大力推動GIOP的機制研究[5]。

本研究發(fā)現(xiàn)地塞米松組股骨近端及L2的骨密度最低(P<0.01)，仙珍骨康組、地塞米松+仙珍骨康組與對照組股骨近端的骨密度的差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，血清指標示血鈣與血磷濃度在各組中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明仙珍骨康膠囊可能不是從影響鈣、磷離子來起到防治骨質(zhì)疏松的作用。但仙珍骨康膠囊能顯著升高小鼠血清中的PTH、PICP及BALP水平，下調(diào)BGP、E2、CT與PROG水平(P<0.01)。研究表明甲狀旁腺素類藥物比二磷酸鹽類藥物更能提高絕經(jīng)婦女骨質(zhì)疏松癥病人腰椎、股骨頸BMD，改善骨質(zhì)量的療效肯定，且安全性較高[9]。此外，亦有研究表明甲狀旁腺素能有效改善糖皮質(zhì)激素長期應用所造成的骨量丟失，增加骨密度，對預防糖皮質(zhì)激素所導致的大鼠骨質(zhì)疏松有顯著作用。甲狀旁腺素是判斷骨質(zhì)疏松關(guān)鍵指標，仙珍骨康膠囊能顯著升高PTH水平表明該藥安全，高效，是SLE性糖皮質(zhì)激素骨質(zhì)疏松的良藥[5,7]。透射電鏡亦表明地塞米松組見成骨細胞溶解，形態(tài)變長；仙珍骨康組見成骨細胞結(jié)構(gòu)正常, 細胞核染色質(zhì)分布均勻；地塞米松+仙珍骨康組見成骨細胞核為卵圓形，有膠原分泌；對照組成骨細胞可見有較多膠原分泌, 細胞中存在大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體[7,9]。

總之，上述研究活體成像、生化指標、電鏡結(jié)果進一步闡明了仙珍骨康膠囊防治骨質(zhì)疏松的機制。表明仙珍骨康膠囊不但能顯著減低絕經(jīng)前SLE患者服用糖皮質(zhì)激素造成的骨質(zhì)疏松或骨量減少，而且糖皮質(zhì)激素耐受患者加服補骨膠囊后可以提高患者對糖皮質(zhì)激素的敏感性。上述研究方法為中成藥防治GIOP的研究提供了新的思路及有效的實驗研究模型。為仙珍骨康膠囊的臨床應用提供了大量的實驗參考數(shù)據(jù)，為其分子機制的研究提供了依據(jù)。

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