何振宇， 汪 耀, 丁慢慢， 林亞維*

(1.武漢市疾病控制預(yù)防中心，湖北武漢 430015;2.武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430070)

糖基化是真核生物內(nèi)最常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾[1]。糖基化修飾會改變蛋白質(zhì)性質(zhì)以及生物活性[2]，它廣泛參與眾多生物進程，如細胞間信號傳遞、細胞-基質(zhì)相互作用以及細胞-細胞相互作用等。因此，糖鏈分析至關(guān)重要[3 - 4]。根據(jù)糖基化位點以及糖類物質(zhì)與蛋白質(zhì)之間連接方式的不同，可將糖蛋白中糖鏈的構(gòu)成類型主要分為兩大類：N-糖鏈與O-糖鏈。目前已發(fā)現(xiàn)N-糖基化異常與許多重大疾病，如癌癥、心血管疾病等均有密切關(guān)系[5 - 6]，研究N-糖鏈的結(jié)構(gòu)變化對于闡明糖鏈在疾病發(fā)生與發(fā)展中的作用，尋找疾病標(biāo)志物進而實現(xiàn)疾病的早期診斷治療乃至藥物的研發(fā)具有重要意義。

復(fù)雜生物基質(zhì)中糖鏈相對豐度較低，且由于糖鏈本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜、無法擴增、離子化效率低[7]、無生色團或熒光基團等因素，N-糖鏈的高靈敏度、高選擇性檢測依然是一個充滿挑戰(zhàn)的課題。糖鏈分析方法主要有核磁共振法(NMR)與質(zhì)譜法(MS)[8 - 9]。其中，基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜法(MALDI-MS)[10]相較于其他方法，具有分析時間短、圖譜解析較為簡單、易于操作等優(yōu)點，能實現(xiàn)快速、高靈敏、高通量的糖鏈檢測。其分析流程大致為：糖蛋白或其他生物樣品經(jīng)酶切等前處理后進行衍生化、純化后質(zhì)譜分析。常用的衍生方法有還原胺化法、肼標(biāo)記法等[11]，它們均通過糖鏈的還原端進行衍生。但N-糖鏈中唾液酸化糖鏈糖苷鍵在質(zhì)譜檢測中易斷裂，進而引起唾液酸殘基的解離與脫落[12 - 14]而導(dǎo)致信號的丟失。因此，通常選擇甲酯化[13]、酰胺化[15]或甲胺化[16]等方法來保證唾液酸的穩(wěn)定性。但這些方法無法實現(xiàn)中性與酸性糖鏈的同時檢測，為生物樣品中聚糖分析引入了誤差。

本文提出一種“雙重衍生化”方法結(jié)合MALDI-MS分析，實現(xiàn)了生物樣品中酸性與中性N-糖鏈的同時檢測。其中，酸性糖鏈衍生采取甲胺化方法，中性糖鏈則采取肼標(biāo)記法。因唾液酸可與肼試劑反應(yīng)而干擾糖鏈還原端的肼標(biāo)記，我們首先選用甲胺化方法中和唾液酸，然后采用吉拉爾特試劑P(GP)對N-糖鏈還原端進行標(biāo)記。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

5800 MALDI-TOF質(zhì)譜儀(美國，AB SCIEX)；真空濃縮儀(德國，Eppendorf)；電子天平(美國，梅特勒-托利多)；WH-2微型漩渦混合儀(上海滬西)；TW50SPE-12S固相萃取裝置(北京東方)。

麥芽七糖、2,5-二羥基苯甲酸(DHB)、三氟乙酸(TFA)、核糖核酸酶B(RNase B)、牛胎球蛋白(Fetuin)、二甲基亞砜(DMSO)、甲胺鹽酸鹽、4-甲基嗎啉、六氟磷酸(7-氮雜苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷磷(PyAOP)(美國Sigma公司)；冰乙酸(國藥集團)；吉拉爾特試劑P(GP)、吉拉爾特試劑T(GT)、甲醇(Aladdin(中國))；β-株蛋白生成障礙性貧血洗脫緩沖試劑包(G7，10X)、10%壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)(美國BioLabs)；肽N-糖酰胺酶F(PNGase F)(250 U，美國ThermoFisher)；多孔石墨化碳(PGC)(ENVI-Carb，中國)；纖維素填料(美國Sigma)。所用試劑如無特別說明均為分析純。純水經(jīng)Milli-Q系統(tǒng)(美國Millipore)純化。

人血清樣品由武漢同濟醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院提供。

1.2 實驗方法

1.2.1GP與麥芽七糖衍生反應(yīng)于1 μL麥芽七糖(0.2 mmol/L)中，分別加入2 μL GP(10 mmol/L)、0.2 μL冰乙酸與16.8 μL純水，60 ℃下反應(yīng)120 min，真空離心干燥，待MALDI-MS分析。

1.2.2RNaseB中中性N-糖鏈GP衍生反應(yīng)(1)標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白RNase B的酶切：10 μg RNase B 100 ℃下煮沸10 min，冷卻后加入12 μL 10% NP-40，靜置30 min。隨后加入PNGase F 0.5 μL，37 ℃下反應(yīng)18 h后，煮沸5 min以終止反應(yīng)。(2)N-糖鏈固相萃取純化：先后用3 mL 80%的乙腈溶液(乙腈/水/TFA:80/19.9/0.1，V/V/V)、3 mL純水預(yù)洗、平衡PGC柱。樣品經(jīng)平衡液稀釋加載到PGC柱中，用3 mL水洗滌，最后用1.3 mL 40%乙腈溶液(乙腈/水/TFA:40/59.9/0.1，V/V/V)洗脫，洗脫液真空離心干燥。(3)GP衍生：干燥樣品用10 μL水溶解，取1 μL與10 μL GP(10 mmol/L)、0.2 μL冰乙酸與8.8 μL純水混合，60 ℃反應(yīng)120 min后，干燥。

1.2.3Fetuin中酸性N-糖鏈的雙重衍生化反應(yīng)(1)酶切與PGC純化同1.2.2項(1)。(2)甲胺化：7 mg 甲胺鹽酸鹽溶于100 μL DMSO，加入5.5 μL 4-甲基嗎啉，混合、離心，配制成A溶液。2.6 mg PyAOP溶于100 μL DMSO，混合、離心，配制成B溶液。取A、B溶液各25 μL加入(1)的干燥樣品，混合均勻，室溫下避光反應(yīng)30 min后，加入正丁醇/乙醇/水(4/1/1，V/V/V)溶液500 μL終止反應(yīng)。(3)纖維素柱純化：3 mL純水、3 mL正丁醇/乙醇/水(4/1/1，V/V/V)預(yù)洗、平衡纖維素柱，平衡液稀釋樣品加載到纖維素柱，3 mL正丁醇/乙醇/水(4/1/1，V/V/V)沖洗柱后1.0 mL乙醇/水(1/1，V/V)洗脫，收集干燥洗脫液。(4)GP與糖鏈的衍生同1.2.2項(3)。

1.2.4人血清N-糖鏈雙重衍生化反應(yīng)同F(xiàn)etuin中酸性糖鏈的雙重衍生化法(1.2.3項)。

1.2.5MALDI-TOFMS檢測(1)干燥樣品溶解在20 μL 50%甲醇/水(V/V)中，取出0.5 μL樣品與0.5 μL基質(zhì)(5 mg/mL DHB、5 mmol/L NaAc的50%甲醇/水(V/V)溶液)混合，點在靶板上，空氣中晾干。(2)質(zhì)譜分析以正離子模式進行。激光光源Nd∶YAG(355 nm，400 Hz)，激光強度為5 500，加速電壓為20 kV，質(zhì)量掃描范圍為m/z1 000～5 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲胺化法

甲胺化反應(yīng)原理如圖1(a)所示。Fetuin糖鏈甲胺化衍生結(jié)果如圖2(B)所示，F(xiàn)etuin所有5種唾液酸化糖鏈([M+Na]+峰)均在質(zhì)譜上有較好響應(yīng)。而未經(jīng)甲胺化衍生則無明顯糖鏈信號(圖2(A))。結(jié)果表明，甲胺化能極大提高唾液酸化糖鏈的檢測靈敏度。

2.2 肼標(biāo)記法

GP與GT試劑與DP7衍生反應(yīng)如圖1(b)所示。因二者均具有一個永久正電荷，其糖鏈衍生產(chǎn)物在質(zhì)譜檢測時離子化效率增強，且質(zhì)譜圖上只呈現(xiàn)其[M]+峰，消除了其他加合物離子峰的干擾[17 - 18]。我們采用麥芽七糖(DP7)為模型聚糖，考察了兩種試劑與聚糖的衍生化反應(yīng)。

本研究中,觀察組患者的腦出血治療效果明顯優(yōu)于對照組,差異顯著(P<0.05),同時觀察組患者的血腫擴大率明顯低于對照組,差異顯著(P<0.05)。因此,在腦出血患者的臨床治療中應(yīng)用小劑量甘露醇進行治療則有更好的應(yīng)用效果,更好地防控血腫擴大,值得在臨床推廣應(yīng)用。

圖1 甲胺化(a)與肼標(biāo)記(b)反應(yīng)式Fig.1 Schematic diagram of methylamidation(a) and hydrazine labeling(b)

圖2 未甲胺化Fetuin(A)和甲胺化Fetuin(B)質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of Fetuin (A) and Fetuin after methylamidation (B)

圖3 (A)DP7的GT衍生質(zhì)譜圖(內(nèi)插圖為GT/DP7摩爾比(a)，反應(yīng)溫度(b)，反應(yīng)時間(c)對GT衍生效率的影響);(B)DP7的GP衍生質(zhì)譜圖(內(nèi)插圖為GT/DP7摩爾比(d)，反應(yīng)溫度(e)，反應(yīng)時間(f)對GP衍生效率的影響)Fig.3 (A)Mass spectrum of DP7 with derivatization of GT (Inset:the derivatization efficiency in relationship to molar ratio of GT to DP7(a)，reaction temperature(b)，reaction time(c))；(B)Mass spectrum of DP7 with derivatization of GP(Inset:the derivatization efficiency in relationship to molar ratio of GP to DP7(d)，reaction temperature (e)，reaction time (f))

GT與DP7衍生反應(yīng)結(jié)果如圖3(A)所示，觀察到明顯DP7-GT衍生產(chǎn)物峰[M]+(m/z1 266.32)，同時也觀察到了未反應(yīng)的DP7信號峰[M+Na]+。為提高衍生效率，我們對反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，得到最優(yōu)的衍生條件為：GT/DP7摩爾比100/1，溫度60 ℃，反應(yīng)時間60 min。當(dāng)溫度大于60 ℃，反應(yīng)時間大于60 min時，衍生效率降低。這說明GT-DP7衍生物不穩(wěn)定、易分解。GP與DP7衍生反應(yīng)結(jié)果如圖3(B)所示，觀測到DP7-GP衍生物信號[M]+(m/z1 286.28)與未反應(yīng)DP7信號。優(yōu)化反應(yīng)條件后，得到最優(yōu)的條件為：GP/DP7摩爾比為100/1，溫度60 ℃，反應(yīng)時間120 min。結(jié)果表明，GP衍生能極大提高聚糖檢測靈敏度。因GP衍生效率高且衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，我們選擇GP試劑進行糖蛋白糖鏈分析。

2.2.3GP衍生化分析RNaseB中N-糖鏈標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白RNase B進GP衍生后結(jié)果如圖4所示。其中圖4(A)為未GP衍生結(jié)果，只檢測到4種糖鏈信號，且背景峰干擾明顯；圖4(B)為GP衍生后結(jié)果，檢測到RNase B所有5種糖鏈，且均為GP衍生化[M]+峰。

圖4 未衍生RNase B(A)和GP標(biāo)記RNase B(B)質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of RNase B N-glycans (A) and RNase B N-glycans after GP labeling (B)

2.3 雙重衍生化分析Fetuin中N-糖鏈

圖5 雙重衍生化Fetuin質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrum of Fetuin after dual derivatization

采用雙重衍生化方法(即甲胺化和后續(xù)的GP衍生)檢測Fetuin中N-糖鏈結(jié)果如圖5所示。與單純甲胺化(圖2(B))相比，雙重衍生化法檢測到Fetuin中所有5種酸性糖鏈，且信號明顯增強。可見雙重衍生化法較單純甲胺化法更能提高糖鏈檢測靈敏度。

2.4 雙重衍生化分析人血清中N-糖鏈

圖6 甲胺化衍生的血清中糖鏈檢測質(zhì)譜圖(A)與雙重化衍生的血清中糖鏈檢測(B)質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectra of N-glycans in serum after methylamidation(A) and after dual derivatization(B)

圖6(A)為人血清只經(jīng)過甲胺化衍生得到的質(zhì)譜圖，從中我們只觀察到三種唾液酸化聚糖的質(zhì)譜信號，而沒有觀察到任何中性糖鏈的信號。圖6(B)為人血清經(jīng)雙重衍生化得到的質(zhì)譜圖，從中我們觀察到了16種N-糖鏈的質(zhì)譜信號，并確定了其糖鏈組成與結(jié)構(gòu),見表1。這16種N-糖鏈包括7種中性糖鏈和9種酸性糖鏈，可以分為4種高甘露糖型糖鏈、7種二天線型糖鏈、3種三天線型糖鏈以及2種平分型糖鏈。其中，二天線型糖鏈豐度較大，且種類最多。這16種糖鏈中有7種糖鏈為巖藻糖化糖鏈，而且均為核心巖藻糖化。由此可見，雙重化衍生同時提高了中性與酸性聚糖的檢測靈敏度，更實現(xiàn)了復(fù)雜基質(zhì)中酸性與中性糖鏈的同時檢測。

表1 血清中糖鏈雙重衍生化質(zhì)譜檢測信號解析

3 結(jié)論

本文發(fā)展了一種高效、快速的雙重衍生化方法用于生物樣品中中性、酸性糖鏈的檢測。在實際檢測量為25 ng的人血清樣品中檢測出16種糖鏈結(jié)構(gòu)。該方法包括修飾唾液酸殘基的甲胺化與針對糖鏈還原端的GP試劑肼衍生，既保證了質(zhì)譜檢測中酸性糖鏈的穩(wěn)定性，又提高了所有聚糖的離子化效率。方法實現(xiàn)了生物樣品中中性、酸性糖鏈的同時檢測；提高了糖鏈檢測的靈敏度與準(zhǔn)確性，為疾病相關(guān)糖鏈標(biāo)志物的檢測提供了新的檢測方法。

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