李志英, 劉 倩, 葛 超, 張海容

(1.忻州師范學(xué)院化學(xué)系 山西忻州 634000;2.忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所,山西忻州 034000)

金納米簇(AuNCs)由于尺寸小、生物相溶性好、光學(xué)穩(wěn)定性好、無毒等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。而AuNCs作為熒光探針展現(xiàn)出的獨(dú)特光學(xué)特性，使其在生物檢測和醫(yī)學(xué)診斷中表現(xiàn)出了很好的前景[1]。

小檗堿是黃連、黃柏等中藥中含量最多的生物堿。研究表明其具有局部麻醉、抗心律失常、治療原發(fā)性高血壓，對痢疾桿菌、鏈球菌等有較強(qiáng)的抑制作用，并有增強(qiáng)白血球吞噬作用，臨床主要用于腸道感染，有較強(qiáng)的體內(nèi)外抗腫瘤活性[2]。而鹽酸小檗堿含量測定是衡量黃連質(zhì)量的重要指標(biāo)，其測定方法主要有高效液相色譜法[3 - 5]、薄層色譜法[6 - 7]、雙波長掃描法[8]、SDS法[9]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳[10]等。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)吐溫20增敏的金納米簇(AuNCs)具有很高的穩(wěn)定性和優(yōu)良的光學(xué)性能，鹽酸小檗堿與AuNCs作用使AuNCs團(tuán)聚，熒光強(qiáng)度降低，據(jù)此，建立了AuNCs熒光探針測定鹽酸小檗堿的新方法。方法簡便、準(zhǔn)確、快速，重復(fù)性好。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

F-4600熒光光度計(jì)(日本，日立公司)；Tecnai G2F205-TWIN透射電子顯微鏡(美國，F(xiàn)EI公司)；FTIR8400傅立葉變換-紅外光譜儀(日本，島津公司)。

HAuCl4·4H2O (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；2-巰基苯并噻唑(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所) ；鹽酸小檗堿(Be -H，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

鹽酸小檗堿片(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司)；黃連、黃柏均購自于山西省忻州市五臺山大藥房。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1AuNCs的合成分別準(zhǔn)確吸取15 mL 0.4 g·L-1的HAuCl4溶液，20 mL 1.0×10-3mol·L-1的D -甘露糖溶液，10 mL 1.0×10-2mol·L-1的2-巰基苯并噻唑溶液，置于100 mL的錐形瓶中，搖勻。將錐形瓶放入數(shù)控超聲波清洗器中，設(shè)置溫度為40 ℃、水位高為80 cm、功率為8 0Hz、超聲50 min，即制得AuNCs。

1.2.2鹽酸小檗堿(Be-H)的測定精確吸取0.5 mL AuNCs溶液，1 mL吐溫20溶液，2 mL pH=7的乙酸緩沖溶液，加入不同濃度的Be-H溶液于10 mL的比色管中，用二次蒸餾水定容，在激發(fā)波長和發(fā)射波長為346/532 nm處測定熒光強(qiáng)度F。計(jì)算:ΔF=F0-F,其中F0為未加Be-H時體系的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNCs的透射電鏡和紅外光譜表征

由圖1透射電鏡(TEM)圖可以看出，制備的AuNCs為比較規(guī)則的球形，直徑為1.7～1.9 nm。由圖2紅外(IR)光譜圖可知：D -甘露糖在2 950 cm-1的O-H 伸縮振動吸收峰向高波數(shù)方向移動；1 760 cm-1為C=O的伸縮振動吸收峰，690 cm-1為C-H的峰，D -甘露糖分子和AuNCs均含有兩種類型的羧基，但AuNCs均減弱。

圖1 AuNCs的透射電鏡(TEM)圖Fig.1 TEM image of AuNCs

圖2 AuNCs和原料的紅外(IR)光譜圖Fig.2 IR spectra of AuNCs and ram material

2.2 AuNCs和實(shí)驗(yàn)體系的熒光光譜

分別配制1.0×10-3mol·L-12-巰基苯并噻唑溶液，1.0×10-4mol·L-1D -甘露糖溶液，一定濃度AuNCs溶液，1.0×10-5mol·L-1的Be-H溶液，在室溫下放置20 min后，在激發(fā)波長為346 nm，發(fā)射波長為532 nm下測量各自的熒光強(qiáng)度。從圖3曲線1可知，2-巰基苯并噻唑發(fā)射波長441 nm，曲線2說明D -甘露糖沒有熒光，由曲線3可知AuNCs發(fā)射波長為532 nm，說明原料對AuNCs的熒光沒有影響。圖4曲線1為AuNCs，曲線2為AuNCs-Be -H的體系，說明Be -H可使AuNCs熒光猝滅，曲線3說明Be -H在532 nm處沒有熒光。

圖3 AuNCs體系的熒光光譜圖Fig.3 The fluorescence spectra of AuNCs system

圖4 測定體系的熒光光譜Fig.4 The fluorescence spectra of measurement system

2.3 反應(yīng)機(jī)理

通過D -甘露糖還原法制備的AuNCs其溶液在532 nm波長處有熒光，粒子外層被過量的D -甘露糖所包圍而顯一定負(fù)電性，穩(wěn)定劑2-巰基苯并噻唑通過Au-S鍵而使粒子也帶上負(fù)電，它容易和正電荷物質(zhì)發(fā)生靜電作用，使AuNCs粒徑變大，隨著粒徑的增大，AuNCs熒光強(qiáng)度也隨之降低。由于電性關(guān)系，Be -H與AuNCs作用，導(dǎo)致AuNCs熒光強(qiáng)度降低。據(jù)此，可以實(shí)現(xiàn)對Be -H的測定。

圖5 AuNCs和鹽酸小檗堿的作用機(jī)理Fig.5 The mechanism of interaction between AuNCs and the berberine hydrochloride

2.4 AuNCs對Be -H的選擇性

為了確認(rèn)AuNCs對Be -H的選擇性，對Be -H及其它一系列有機(jī)物及中藥中常見物質(zhì)的干擾進(jìn)行測定。由圖6可知，在1.0 ×10-6mol·L-1相同濃度下，Be -H可以跟AuNDs作用，使其熒光猝滅。F/F0值的巨大差異表明了AuNCs對Be -H的良好選擇性。

2.5 表面活性劑的種類及用量的選擇

圖6 AuNCs對不同物質(zhì)的響應(yīng)Fig.6 Response of AuNCs to different compounds

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法，分別試驗(yàn)了表面活性劑CTMAB、OP乳化劑、吐溫80、吐溫60、吐溫20、SDS表面活性劑對AuNCs熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明吐溫20的增敏效果最好,所以本實(shí)驗(yàn)選定吐溫20為增敏劑。同時準(zhǔn)確吸取不同濃度的1∶5 000(V/V)的吐溫20溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明吐溫20用量為1 mL時ΔF最大，所以本實(shí)驗(yàn)選用體積比為1∶5 000的吐溫20溶液1 mL。

2.6 pH對體系的影響

以乙酸緩沖溶液為介質(zhì)，調(diào)節(jié)測定體系的pH，研究pH對體系的影響。ΔF隨pH的升高先增大后減小，當(dāng)pH=7時，ΔF最大，故選擇pH=7的乙酸緩沖體系為反應(yīng)介質(zhì)。

2.7 反應(yīng)時間和溫度對體系的影響

體系在5 min后反應(yīng)完全，并且在30 min內(nèi)ΔF基本不變，為方便測定故實(shí)驗(yàn)選擇在10 min后測定。設(shè)定不同的溫度：20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃，進(jìn)行反應(yīng)7 min，用流水冷卻3 min。結(jié)果表明：不同溫度條件下ΔF保持相對穩(wěn)定,故實(shí)驗(yàn)選擇在室溫下進(jìn)行。

2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

按實(shí)驗(yàn)方法配制0、0.05、0.06、0.08、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0 μmol·L-1Be -H溶液，以未加Be -H溶液的空白溶液作參比，于激發(fā)波長346 nm處測定熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Be -H的濃度在5.0×10-8～4.0×10-6mol·L-1范圍內(nèi)的線性回歸方程為：ΔF=332.1c+99.7(c:μmol·L-1)，相關(guān)系數(shù)r2=0.9935。求得其標(biāo)準(zhǔn)偏差(S)為0.854，利用3S/K公式求得檢出限為7.7×10-9mol·L-1。

2.9 樣品的測定

取鹽酸小檗堿片10粒,研細(xì),稱取40 mg細(xì)粉至燒杯中，加沸水適量使其溶解，冷卻至室溫，過濾后，移取濾液1 mL定容到100 mL容量瓶中。中藥的處理：稱取過篩的中藥細(xì)粉2 g，加入40 mL無水乙醇和20 mL二次蒸餾水，在70 Hz功率下，超聲提取數(shù)次，過濾，濾液定容到100 mL容量瓶中[11]。按實(shí)驗(yàn)方法測定，結(jié)果如表1。

表1 樣品測定結(jié)果和回收率

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在水溶液中以2-巰基苯并噻唑?yàn)榉€(wěn)定劑，D -甘露糖為還原劑，HAuCl4為原料，在80 Hz的超聲波下制備AuNCs，用熒光光譜研究了經(jīng)吐溫20增敏的AuNCs作為熒光探針對中藥鹽酸小檗堿的檢測。結(jié)果表明在中性環(huán)境中，室溫下反應(yīng)10 min后，體系熒光強(qiáng)度下降，且熒光強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與鹽酸小檗堿的濃度成正比，線性范圍為5.0×10-8～4.0×10-6mol·L-1，檢出限為7.7×10-9mol·L-1，回收率為97.5%～105%。

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