韓海霞， 弓巧娟, 秦建芳， 王玉春， 姚陳忠

(1.山西師范大學化學與材料科學學院，山西臨汾 041000;2.運城學院應用化學系，山西運城 044000)

石墨烯在電化學傳感器的研究中備受關注[1 - 3]。蘆丁屬于黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗脂肪細胞與抗腫瘤活性等諸多藥理和生理活性[4]，已用于治療血管疾病、冠狀動脈硬化、高血壓以及關節(jié)炎等疾病[5]。目前檢測蘆丁的方法有高效液相色譜法[6]、分光光度法[7]、毛細管電泳[8]和電化學方法[2]等。電化學方法因檢測速度快，靈敏度高以及易微型化等優(yōu)勢在蘆丁藥物分析研究中倍受青睞[9]。

蘆丁在石墨烯復合材料上電化學行為的研究已有報道[10 - 11]，但采用氨基酸，特別是聚半胱氨酸(Poly-L-Cys) 修飾電極作為蘆丁傳感器尚未見報道。L-Cys分子中含有氨基、巰基和羥基等活性基團[12]，為蘆丁在電極表面上的吸附提供了較豐富的活性位點[10]。本文使用聚Poly-L-Cys/rGO/Nafion修飾玻碳電極，研究了蘆丁在其上的電化學行為，由此建立的蘆丁電化學傳感器與文獻報道[9]相比，大大提高了檢測靈敏度，為蘆丁藥物的檢測及分析提供了一種新的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI 660 型電化學工作站(上海辰華儀器公司)，實驗采用三電極體系：Poly-L-Cys/rGO/GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲為輔助電極；pHS-3C型pH 計(上海雷磁儀器公司)。

L-半胱氨酸(上海生工公司)，蘆丁標準品(上海捷潤公司)，石墨粉(東華石墨廠)，復方蘆丁片(亞寶藥業(yè)公司)，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，其它試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 Poly-L-Cys/rGO/GCE的制備

1.2.1玻碳電極預處理將玻碳電極(GCE)用0.05 μm Al2O3粉末在麂皮上拋光，然后用二次蒸餾水沖洗干凈，紅外燈烘干后，備用。

1.2.2rGO/GCE的制備采用改進的Hummers法合成氧化石墨烯(GO)[13]。用水合肼還原GO得到還原氧化石墨烯(rGO)。稱取1 mg rGO超聲分散于2 mL 0.2%的Nafion溶液中2 h，得0.5 mg/mL的rGO/Nafion溶液。移取5 μL rGO/Nafion溶液，滴涂于處理后的GCE表面，紅外燈烘干，得rGO/Nafion/GCE。

1.2.3Poly-L-Cys/rGO/GCE的制備將rGO/Nafion/GCE浸入 pH=7.0的1.0×10-3mol/L的L-Cys溶液中，于電位-0.8～+2.2 V，在掃速100 mV/s下進行循環(huán)伏安(CV)掃描，取出電極用二次蒸餾水淋洗，于紅外燈下烘干，得Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE。用上述同樣方法制備Poly-L-Cys/GCE。

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描電鏡表征

從圖1A可知，GO非單片層，表面粗糙且邊緣呈皺褶狀，表明GO未完全剝離。從圖1B可見，rGO層狀結(jié)構(gòu)非常明顯，且片層比較薄，說明rGO得到了很好的剝離，rGO層與層之間相互重疊，表明所制備的rGO是多層結(jié)構(gòu)，且GO已被充分還原。從圖1C可看到rGO表面擁有細小的顆粒，但分布并不均勻，這可能由于聚合過程中一部分L-Cys未能很好地吸附在rGO的表面，同時也表明L-Cys已成功聚合到rGO/Nafion/GCE表面。

圖1 GO(A) rGO(B)和Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE(C)的掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM of GO(A),rGO(B) and Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE(C)

2.2 蘆丁在不同電極上的電化學行為

采用CV法研究了蘆丁在不同電極上，在含1.0×10-5mol/L蘆丁的0.1 mol/L的 PBS(pH=2)中的電化學響應。從圖2可知，蘆丁在裸GCE上于0.58 V處的峰電流為2.9 μA(曲線a)，與之相比，Poly-L-Cys/GCE的峰電流值迅速增大至8.48 μA(曲線b)。這是因為蘆丁中的羥基與L-Cys中的氨基作用形成氫鍵，使電子轉(zhuǎn)移速度加快；當修飾電極為rGO/Nafion/GCE時，峰電流值增加到12.1 μA(曲線c)，應源于rGO優(yōu)良的導電性能以及大的比表面積，提高了電極對蘆丁的負載量；當用Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE測定蘆丁時，峰電流值達到17.5 μA，源于L-Cys的催化性能和rGO的優(yōu)良性能，增加了反應活性位點，表現(xiàn)了L-Cys與rGO之間良好的協(xié)同作用。

2.3 L-Cys 聚合時間的優(yōu)化

通過電聚合圈數(shù)來研究L-Cys 聚合時間對電極導電性能的影響。實驗比較了聚合L-Cys圈數(shù)分別為5、10、15、20、35對電極性能的影響。結(jié)果表明，隨掃描圈數(shù)的增加，峰電流(I)也隨之增加，當掃至20圈時峰電流達到最大，之后隨掃描圈數(shù)的增加，峰電流開始下降。說明隨掃描圈數(shù)的增加，電極表面上的修飾膜的厚度也在增加，阻礙了電子的轉(zhuǎn)移，峰電流降低，故后續(xù)實驗采用掃描20圈制備修飾電極。

2.4 實驗條件的優(yōu)化

2.4.1溶液pH的影響考察了在不同pH的PBS中蘆丁的CV行為。從圖3中可看出，當pH=2時峰電流達到最大值，之后隨溶液pH的增大，峰電流逐漸降低，峰電位負移，且pH與峰電位(E)呈良好線性關系，線性方程分別為：Epa(V)=-0.0605pH+0.7459(R2=0.9956)和Epc(V)=-0.0610pH+0.7004(R2=0.9967)，兩方程中的斜率分別為60.5 mV/pH和61.0 mV/pH，這與能斯特值59 mV/pH很接近，說明參與電極反應的質(zhì)子和電子的比例為1∶1[14]。因此選擇pH=2的PBS為最佳電解質(zhì)溶液。

2.4.2掃描速率的影響用CV法考察掃速v對蘆丁峰電流的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，掃速在20～900 mV/s范圍內(nèi)，隨掃速的增加，氧化還原峰電流也逐漸增加；且峰電位差逐漸增大，同時且發(fā)現(xiàn)峰電流與掃速v呈良好的線性關系，線性方程分別為：Ipa(μA)=-0.1284logv-6.1323(R2=0.9940)和Ipc(μA)=0.0943logv+3.3281(R2=0.9957)，表明該電極反應受吸附控制過程。

圖2 蘆丁在GCE(a)、Poly-L-Cys/GCE(b)、rGO/ Nafion/GCE(c)和Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE(d)上的循環(huán)伏安(CV)曲線Fig.2 CV curves of rutin at GCE(a),Poly-L-Cys/GCE(b),rGO/Nafion/GCE(c) and Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE(d)

圖3 Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE在含1.0×10-5 mol/L蘆丁的不同pH的PBS中的循環(huán)伏安(CV)圖Fig.3 CVs of 1.0×10-5 mol/L rutin at Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE in PBS buffers with different pH valuespH(a-g):2,3,4,5,6,7,8.

2.5 蘆丁的檢測

圖4 不同濃度蘆丁在Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE上的示差脈沖伏安(DPV)圖Fig.4 DPV of different concentrations of rutin at Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCEa→j:2.0×10-8～1.0×10-5 mol/L.

在優(yōu)化條件下，使用示差脈沖伏安法(DPV)考察了該傳感器對蘆丁的響應能力。由圖4可見，隨蘆丁濃度的增大，峰電流隨之線性增加，且濃度在2.0×10-8～1.0×10-5mol/L范圍內(nèi)與峰電流呈良好線性關系，線性方程為：I(μA)=-4.1181c+3.0502(R2=0.9970)，檢出限(S/N=3)為1.0×10-8mol/L。結(jié)果表明，該傳感器擁有較寬的檢測范圍和較低的檢出限，靈敏度較高。這源于L-Cys 和rGO之間的協(xié)同作用改進了電極表面的性能。

2.6 穩(wěn)定性、重復性和干擾實驗

2.7 樣品分析

取2片復方蘆丁片(20 mg/片)，放入研缽研磨成粉末，用無水乙醇溶解后過濾，濾液定容至100 mL，得濃度為6.5×10-4mol/L儲備液。分別移取100 μL儲備液于3個10 mL離心管中，然后分別加入1、2、3 mL 1.0×10-5mol/L蘆丁標準液，用pH=2的PBS定容至刻度。使用標準加入法進行DPV檢測，結(jié)果見表1。從表可得，該傳感器的回收率在97%～103%之間。

表1 蘆丁樣品的含量測定(n=5)

3 結(jié)論

制備了修飾電極Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE。該傳感器因rGO大的比表面、較快的電子轉(zhuǎn)移速率和L-Cys較高的電催化活性，從而使其對蘆丁的吸附以及電催化氧化活性提高。在最優(yōu)條件下，該傳感器對蘆丁有寬的線性范圍和較低的檢測限，可用于真實樣品中蘆丁簡便有效測定。

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