楊中華， 張立娜， 張 錦， 高敬林， 龐海英， 王 薇， 王聰聰， 蔣 曄*

(河北醫(yī)科大學藥學院，河北石家莊 050017)

青霉素V鉀屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素[1]，是一種重要的原料藥和醫(yī)藥前體，在國內(nèi)外廣泛應用于口服制劑加工、半合成青霉素和頭孢菌素的生產(chǎn)，是裂解生產(chǎn)6-APA等半合成抗生素中間體的重要原料[2]。青霉素V鉀主要通過發(fā)酵法產(chǎn)生[3]，由于菌絲和發(fā)酵培養(yǎng)基需要添加碳氮源麩質粉、乳糖、硫酸銨、玉米漿等，青霉素V鉀在發(fā)酵過程中易產(chǎn)生蛋白多肽等大分子雜質[4]。雖然發(fā)酵工藝和純化制備工藝不斷改進，但發(fā)酵過程中的蛋白等大分子物質仍可能殘留于終產(chǎn)品中而引起人體內(nèi)的諸多不良反應[5]。故用靈敏的痕量蛋白檢測方法對青霉素V鉀等發(fā)酵產(chǎn)品進行有效的工藝驗證、在線監(jiān)測及考察是極其重要的。

采用常規(guī)的光譜等分析方法[6]檢測蛋白質存在基質影響大、操作復雜、結果不準確、靈敏度低等問題。即使采用了高靈敏度的現(xiàn)代分析方法如質譜等，其分析檢測靈敏度仍然不高[7]，故需在樣品前處理時對蛋白質進行分離富集。目前，痕量蛋白質富集技術已由透析袋濃縮法、冷凍干燥濃縮法、沉淀法、萃取法等傳統(tǒng)非在線富集技術，發(fā)展到場放大堆積技術[8]、掃集技術[9]、等速電泳[10 - 12]、pH調節(jié)濃縮技術[13]等在線富集手段。然而這些富集技術存在操作繁瑣、大量使用有毒有機溶劑、蛋白質易變性等問題。雖然國外已商品化的平膜裝置是一種利用離心超濾原理富集大分子的裝置，但在富集大分子過程中普遍存在濃差極化、吸附、富集液干燥[14 - 15]等問題。

本實驗利用中空纖維超濾膜特異性截留大分子的原理，采用中空纖維離心超濾(HFCF-UF)富集青霉素V鉀中的蛋白雜質，離心過程中離心力與中空纖維膜一直是平行的狀態(tài)，消除了濃差極化，離心時中空纖維浸沒在濾液中，避免了濃縮物干燥的問題，同時通過對膜進行親水性基團的移植減小了吸附現(xiàn)象，同時本研究還使用將末端吸收波長作為檢測波長的高效凝膠排阻色譜法(HPSEC)對蛋白雜質進行含量測定。經(jīng)富集后的方法靈敏度比質譜法提高了約30倍[7]，比常用的測定蛋白的考馬斯亮藍法[16]提高了300多倍，為同類藥物中的痕量大分子的檢測提供了一種新的富集和檢測手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000液相色譜儀(美國，戴安公司)；LXJ-64-01離心機(北京醫(yī)療儀器修理廠)；聚砜中空纖維(PS)(杭州凱潔膜分離技術有限公司，壁厚150 μm，內(nèi)徑1 000 μm，截留分子量10 kD)。

青霉素V鉀(華北制藥股份有限公司提供，批號及含量分別為：20051508041(99.0%)、20051508042(98.9%)、20051508043(99.2%)、20051508044(99.4%)、20051508045(98.9%)、20051508046(99.0%))。牛血清蛋白(BSA)對照品(New Zealand )，其他試劑均為分析純，水為重蒸水。

1.2 溶液配制

對照品溶液：精密稱取BSA 10.0 mg于100 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，制備成100.0 μg/mL儲備液。分別精密吸取適量的儲備液，加入流動相進行稀釋，混勻，定容得濃度為1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL的對照品溶液。

供試品溶液：取約1.0 g的青霉素V鉀樣品，精密稱定，用流動相溶解并稀釋定容至10 mL，將3 mL 樣品溶液置于圖1a所示的富集裝置中，超濾離心(671 g,10 min)后，用微量注射器取出富集液，作為供試品溶液。

1.3 HFCF-UF裝置制作及富集過程

圖1 HFCF-UF裝置示意圖及富集過程Fig.1 The schematic diagram of the HFCF-UF unit and the enrichment procedure(a)introduction of test solution into the enrichment device；(b)macromolecules were concentrated in the hollow fiber after centrifugation；(c)removal of the retentate by a 100 μL syringe.

將PS膜切成約9 cm的小段，彎曲成U形，放入一5 mL離心管中，取另一個5 mL離心管(將離心管底部剪掉)與該離心管用環(huán)氧樹脂膠粘合，并插入兩個針頭連接，并將PS膜粘在兩個針頭上，做成如圖1a所示的裝置。使用前，向PS膜內(nèi)部打入適量5%的吐溫20，并向中空纖維所在的離心管中加入適量5%的吐溫20以浸泡中空纖維，超聲20 min后繼續(xù)浸泡9 h，備用。使用時，將3 mL樣品溶液(0.1 g/mL青霉素V鉀樣品溶液)置于圖1a裝置中，超濾離心(671 g,10 min)，大分子將被富集在中空纖維內(nèi)部，用微量注射器取出富集液，作為供試品溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱：TSK gel Super SW2000凝膠排阻柱(300×4.6 mm，4 μm)；流動相：0.06 mol/L NaCl-0.02 mol/L Na2HPO4(pH=7.0)；流速：0.3 mL/min；檢測波長：220 nm；進樣量：20 μL；柱溫：室溫。

2 結果與討論

2.1 非特異性吸附現(xiàn)象的處理及影響參數(shù)的優(yōu)化

2.1.1非特異性吸附現(xiàn)象的處理非特異性吸附(NSB)是在排阻色譜和膜分離技術中一個普遍存在的問題[15,17 - 18]，同時也是影響痕量蛋白富集回收率的一個很重要的因素。為了解決排阻色譜柱對蛋白的吸附問題，我們選擇了在其硅膠基質表面鍵合了親水性基團的TSK gel Super SW2000色譜柱對蛋白進行分析，大大減弱了吸附現(xiàn)象，同時為了進一步減小吸附，進樣前我們對蛋白柱用高濃度的BSA對其進行預飽和，從而基本消除了排阻色譜柱對蛋白吸附的影響。

PS膜具有化學穩(wěn)定性好、強度高、變形性好等優(yōu)點，故本研究中選用了PS膜進行試驗。為降低蛋白的吸附，我們首先嘗試了用BSA預飽和的方法來降低PS膜對后面富集物的吸附，但是由于無法避免離心過程中預飽和的BSA從PS膜上脫落，測定回收率超過了100%，故該方法測定不準確。后考慮到PS膜對蛋白吸附是由于其疏水性，可在PS膜上移植親水性基團，改善PS膜的疏水性。而非離子表面活性劑由親水基和疏水基所構成，由于官能團的作用，非離子表面活性劑會在與它相接的膜界面上形成致密的親水層，從而改善膜的親水性[19]。本實驗選用5%的吐溫20水溶液對PS膜進行處理，并考察了浸泡時間、離心力及離心時間的影響。

2.1.2浸泡時間的考察將PS膜用5%的吐溫20分別處理1、3、5、7、9、12、24 h后，分別取3 mL濃度為1.00 μg/mL的BSA溶液，放入圖1所示的裝置在671 g離心力下離心10 min。結果所示，當浸泡時間逐漸延長時，EF逐漸增加；但超過9 h后，由于膜的通透性逐漸變差，樣品溶液離心不完全，因此選取浸泡9 h用于后續(xù)的實驗，實驗結果見圖2a。

2.1.3離心力及離心時間的考察取3 mL濃度為1.00 μg/mL的BSA溶液放入圖1所示的裝置中，固定浸泡時間為9 h，離心時間為10 min，分別考察不同離心力671 g(2 000 r/min)、1 048 g(2 500 r/min)、1 509 g(3 000 r/min)、2 054 g(3 500 r/min)、2 683 g(4 000 r/min)對超濾效率的影響。固定浸泡時間為9 h，離心力為671 g(2 000 r/min)，考察不同離心時間10、15、20、25、30 min對超濾效率的影響。由圖2b、圖2c結果所示，離心力為671 g(2 000 r/min)，離心時間為10 min時，EF最高。

圖2 各因素對富集倍數(shù)的影響 Fig.2 Effect of various factors on the EF obtained from HFCF-UF (a)dipping time，(b)centrifugal force，(c)centrifugal time.

2.2 方法學驗證

圖3 空白溶液(a)、BSA溶液(b)和青霉素V鉀溶液(c)色譜圖Fig.3 Chromatograms of blank solution(a),BSA solution(b) and phenoxymethylpenicillin potassium(c)1.phenoxymethylpenicillin potassium(0.1 g/mL;2.multimeric proteins;3.BSA(50.0 μg/mL).

2.2.1專屬性實驗在上述色譜條件下分別取空白溶液(流動相)、BSA溶液(50.0 μg/mL)、青霉素V鉀樣品溶液(0.1 g/mL)各20 μL，進行色譜分析，得圖3。可見BSA峰與其余峰分離良好，樣品基質不干擾BSA的測定。

2.2.2線性關系在上述色譜條件下，取濃度為1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL的BSA對照溶液各20 μL，分別進樣分析，記錄色譜峰，以峰面積(y)為縱坐標，濃度(x)為橫坐標，計算回歸方程和相關系數(shù)。其回歸方程為：y=0.210x-0.112(R2=0.999)，BSA在1.0～100.0 μg/mL的范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.3精密度和回收率取含低、中、高三個濃度(1.0、50.0、100.0 μg/mL)的BSA樣品溶液(樣品批號為：20051508046，樣品中未檢測到BSA雜質)，在同一天內(nèi)連續(xù)進樣三次，記錄峰面積，計算相對標準偏差(RSD)分別為0.8%、0.5%、0.2%，表明精密度良好。取含低、中、高三個濃度(1.0、50.0、100.0 μg/mL)的BSA樣品溶液(樣品批號為：20051508046，樣品中未檢測到BSA雜質)，且每個濃度的樣品取三份，按1.3節(jié)對樣品進行富集處理，將得到的富集液再稀釋至富集前的體積，分別取20 μL進行分析，記錄色譜圖，計算回收率，見表1。

表1 回收率試驗結果

2.2.4耐用性換用不同的檢測波長(218、220、222 nm)、流速(0.28、0.30、0.32 mL/min)對1.0 μg/mL的BSA對照品溶液進行測定，測得不同波長下峰面積的RSD為1.7%，不同流速下峰面積的RSD為1.5%，說明該方法耐用性良好。

圖4 1.0 μg/mL BSA供試品溶液富集前(a)和富集后(b)的色譜圖Fig.4 Chromatograms of 1.0 μg/mL BSA sample solution before concentration(a) and after concentration(b)1.BSA;2.phenoxymethylpenicillin potassium.

2.2.5富集倍數(shù)及檢測限的考察取含1.0 μg/mL BSA供試品溶液3份，分別經(jīng)HFCF-UF裝置富集，計算富集倍數(shù)，求得平均EF為99倍，見圖4。因該方法BSA濃度為0.3 μg/mL時，信噪比(S/N)=2.8，故檢測限為：0.3 μg/mL/99=3.03 ng/mL。

2.3 含量測定

取青霉素V鉀6批，制備供試品溶液進行分析，樣品中均未檢測到蛋白雜質。為了驗證BSA在青霉素V鉀中的可測性，向批號為：20051508046的青霉素V鉀樣品加入3.03 ng/mL BSA對照品溶液，按照1.2節(jié)制備供試品溶液，經(jīng)富集后可檢測到BSA的色譜峰，其信噪比達2.7，證明該方法可成功檢測到樣品中低至3.03 ng/mL的痕量蛋白質。

2.4 本方法與其他蛋白測定方法靈敏度對比

目前中國藥典和ICH尚未見對青霉素V鉀等發(fā)酵類產(chǎn)品的殘留蛋白提出控制要求，但美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)、歐洲藥品管理局(EMA)均對發(fā)酵類產(chǎn)品提出了控制發(fā)酵殘留物質的要求。然而目前對發(fā)酵類產(chǎn)品中殘留蛋白的研究報道較少[5,20]。本方法與其他常用測定蛋白的方法相比不僅克服了因基質干擾、操作步驟繁瑣而影響蛋白測定準確性的問題，且大大提高了靈敏度，具體比較見表2。極高的靈敏度可以對發(fā)酵類產(chǎn)品殘留蛋白進行更嚴格的控制，最大限度的控制產(chǎn)品質量，保證用藥安全。

表2 測定蛋白方法的靈敏度比較

3 結論

本研究建立了一種新的膜分離技術對樣品中痕量蛋白進行分離富集，并利用末端吸收的HPSEC方法可成功檢測到樣品中低至3.03 ng/mL的大分子蛋白。該樣品前處理HFCF-UF是在半封閉的情況下完成對樣品的富集的，減少了外來人員及環(huán)境的污染，從而減少了假陽性的情況。使用該裝置對樣品進行前處理，快速、有效、操作簡單，為其他同類藥物中的大分子雜質的檢測提供了一種可借鑒的手段。

參考文獻：

[1] Vellore S A,Priyabrata P,Deepak C,Arvhana P,Cheravakattu G S,Sureshkumar R.Journal of Structural Biology,2016,193(2):85.

[2] Arroyo M,Mata I D L,Acebal C,Castillon M P.Applied Microbiology and Biotechnology,2003,60(5):507.

[3] Genowefa P,Katarzyna M,Stefan T.Jounal of Chromatography A,2005,1087:197.

[4] Yang S,Zhu X,Wang J,Jin X,Liu Y,Qian F,Zhang S,Chen J.Bioresource Technology,2015,193:156.

[5] WANG Y,YAO S C,CHANG Y,et al.Chinese Journal of New Drug(王琰,姚尚辰,常艷，等.中國新藥雜志),2015,24(10):1178.

[6] 2.5.33 Total protein,European Pharmacopoeia 8.0.

[7] WANG S S,ZHAO R S,YUAN J P,et al.Jonrnal of Instrumental Analysis(王珊珊,趙汝松,苑金鵬,等.分析測試學報),2011,27(1):60.

[8] Zhang L,Yin X F.Jounal of Chromatography A,2006,1137:243.

[9] Jen H P,Tsai Y C,Su H L,Hseieh Y Z.Jounal of Chromatography A,2006,1111:159.

[10] Takeda S,Fukushi K,Chayama K,Nakayama Y,Tanaka Y,Wakida S.Jounal of Chromatography A,2004,1051:297.

[11] Jeong Y,Choi K,Kang M K,Chun K,Chung D S.Sensor and Actuators B-Chemical,2005,104(2):269.

[12] Prest J E,Baldock S J,Day P J R,Fielden P R,Goddard N J,Brown B J T.Jounal of Chromatography A,2007,1156:154.

[13] Kim J B,Okamoto Y,Terabe S.Jounal of Chromatography A,2003,1018:251.

[14] Vincenzo V,Au V,Bugnaux S B.United States Patent,5647990,1997.

[15] Li J M,Jiang Y,Sun T,Kang L Y.Jounal of Chromatography A,2009,70:1023.

[16] SHAO H,Lü J,CHEN G.Drug Standards of China(邵泓,呂晶,陳鋼.中國藥品標準),2011,12(2):135.

[17] Li W,Lin H,Smith H T,Tse F L S.Jounal of Chromatography B,2011,879:1927.

[18] Wang C G,Williams N S.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2013,75:112.

[19] LU X F,CHEN S Y,LI C Z,WANG B F.Membrane Science and Technology(陸曉峰,陳仕意,李存珍,王彬芳.膜科學與技術),1997,17(4)：36.

[20] XU M Z,MA S,HU C Q.Journal of Pharmaceutical Sciences,2004,13(4):262.