木合塔爾·吐爾洪， 楚剛輝， 尹學(xué)博，木尼熱·阿布都克力木

(新疆特色藥食用植物資源化學(xué)重點實驗室，喀什大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆喀什 844006)

庫魯木提草，又稱矮膜苞芹(Hymenolymanana)，主要產(chǎn)于塔什庫爾干和葉城等帕米爾高原的高海拔地區(qū)，屬于維族地區(qū)傳統(tǒng)民族藥物中的珍稀藥材，可用于防治糖尿病[1 - 2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，庫魯木提草不僅具有明顯的降血糖的作用，而且能使糖尿病多飲多食的癥狀逐漸緩解并存在一定的劑量依賴關(guān)系[3]。柚皮苷又名柚苷、柑橘苷或異橙皮苷，全稱為柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，屬于雙氫黃酮類化合物[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，柚皮苷具有多種藥理作用，在降血脂、抗氧化、抗腫瘤和抗菌等方面顯示較強的生物活性[5 - 6]。木犀草素化學(xué)名稱為3,4,5,7-四羥基黃酮，具有抗炎、抗氧化和保護神經(jīng)系統(tǒng)的作用。研究表明木犀草素還能夠保護肝臟和心血管系統(tǒng)，預(yù)防和減少骨質(zhì)疏松，同時具有良好的抗腫瘤作用，能有效促進機體抑制胃癌、肝癌、前列腺癌和乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖[7 - 8]。鑒于柚皮苷及木犀草素的重要藥理作用，已有相關(guān)植物藥及成藥中柚皮苷及木犀草素的高效液相色譜(HPLC)測定方法的報道[9 - 12]。

中藥及成藥中多種成分同時測定比單組分的測定更能夠反映出它們的總體質(zhì)量，因而近年來得到廣泛關(guān)注[13 - 22]。目前，有關(guān)新疆庫魯木提草的研究報道較少。本文以新疆南疆民族藥物中的珍稀藥材庫魯木提草為研究對象，通過HPLC法檢測其中的兩種活性成分柚皮苷和木犀草素的含量，希望為庫魯木提草的質(zhì)量評價及開發(fā)應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-20AT型高效液相色譜儀(日本，島津公司)，附SPD-M20A二極管陣列檢測器、DGU-20A5在線脫氣機、LC-20AT高壓泵、LC-solution工作站；KQ3200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；WJS-100型高速多功能粉碎機(上海緣沃工貿(mào)有限公司)。

柚皮苷和木犀草素對照品(純度均≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，甲醇(色譜純，天津光復(fù))，冰乙酸(分析純，天津賽孚瑞科技)，其他試劑為國產(chǎn)分析純。水為超純水，并經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾。

選擇新疆南疆產(chǎn)野生和人工種植的庫魯木提草，并經(jīng)由葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源重點實驗室司馬義教授鑒定。將兩種庫魯木提草樣品于60 ℃烘干，粉碎并過40目篩后，在樣品瓶中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 溶液的配制

1.2.1混合對照品溶液精確稱取柚皮苷和木犀草素對照品，加甲醇溶解并定容至100 mL，制成柚皮苷和木犀草素濃度分別為2 400 mg/L、350 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

1.2.2供試品溶液準(zhǔn)確稱取1.000 g庫魯木提草，置于具塞錐形瓶中，精確加入50.00 mL 80%甲醇水溶液，密塞，精密稱量，浸泡過夜，超聲20 min，放冷至室溫。用上述甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，得到庫魯木提草供試品溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent HC-C18柱(250×4.6 mm,5 μm)；以甲醇為流動相A，以0.2%乙酸水溶液為流動相B；流動相流速為1.0 mL/min；梯度洗脫條件：0～40 min，35%～100%A。柱溫為室溫；進樣量為10 μL；檢測波長為254 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

圖1 混合對照品(a)、供試品(b)和加標(biāo)樣(c)的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed reference substance (a),sample (b) and spiked sample (c)

圖2 甲醇濃度對組分含量的影響 Fig.2 Effects of methanol concentration on the component contents

為了獲得庫魯木提草提取液良好的色譜分離效果，分別試驗了甲醇-水和甲醇-0.2%乙酸水溶液為流動相對分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用甲醇-水作為流動相，兩種被測組分色譜峰拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重。而以甲醇-0.2%乙酸水溶液為流動相，可以得到較為滿意的分離效果。采用二極管陣列檢測器選擇檢測波長，發(fā)現(xiàn)庫魯木提草提取液中兩種活性組分在254 nm均有較高的響應(yīng)信號，而且色譜峰峰形良好，并與其他組分有較好的分離效果，故選擇254 nm作為本實驗的檢測波長?；旌蠘?biāo)樣、樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖見圖1。從圖1可以看出，樣品中的兩種活性成分柚皮苷和木犀草素相互之間以及它們與其他組分之間均實現(xiàn)了良好的色譜分離。

2.2樣品提取方法考察

為了得到被測組分良好的提取率，稱取1.0 g野生庫魯木提草樣品，分別以70%、80%和90%的甲醇水溶液以及純甲醇對其中的兩種目標(biāo)物進行提取并測定，測得的含量見圖2。由圖可以看出，甲醇比例對木犀草素的提取影響較小，而對柚皮苷的提取影響較大；純甲醇對柚皮苷的提取效果欠佳，隨著提取溶劑中適當(dāng)增加純水比例可以有效提高柚皮苷組分的提取量，但當(dāng)用70%甲醇水溶液提取時，提取量有所降低，而且提取液較難通過微孔濾膜過濾，這可能是由于樣品溶出多糖的影響。綜上所述，80%(V/V)的甲醇水溶液對于兩種組分的提取效果良好，而且易于過濾膜。因此，選擇80%(V/V)的甲醇水溶液用于庫魯木提草樣品中兩種有效成分的提取。為了保證樣品中有效成分的充分溶出，干燥粉碎的樣品經(jīng)浸泡過夜后再超聲，超聲時間為20 min。

2.3 色譜峰的確定

在標(biāo)準(zhǔn)品和樣品提取液的色譜圖(圖1)中，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中柚皮苷、木犀草素的保留時間分別為13.415、21.924 min，樣品提取液中柚皮苷、木犀草素的保留時間分別為 13.326、21.786 min。經(jīng)過保留時間比對和加標(biāo)樣品分析可初步確認(rèn)兩個色譜峰組分的歸屬。為了進一步驗證兩個色譜組分，通過樣品提取液的二極管陣列3D圖得到兩個組分的吸收光譜圖。再將兩個組分對應(yīng)色譜峰的光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收光譜圖比對，兩個吸收光譜的主要吸收峰峰位基本吻合(圖3)。兩種光譜圖的差異可能是由于溶劑影響與雜質(zhì)組分干擾，以及二極管陣列檢測器本身光譜采集精度問題引起的。因此，通過混合標(biāo)準(zhǔn)樣和樣品提取液中兩個組分色譜峰的保留時間，以及它們吸收光譜主要峰位的吻合程度，可以確認(rèn)樣品色譜圖中這兩個組分的歸屬。

圖3 提取色譜峰(A)和對照品(B)的紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜圖Fig.3 UV-Vis absorption spectra of chromatographic peaks(A) and standard sample(B)

2.4 線性關(guān)系

準(zhǔn)確吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，分別置于10 mL容量瓶中，配制濃度分別為120、240、360、480、720、1 200 和1 440 mg/L的柚皮苷，以及濃度分別為17.5、35、52.5、70、105、175和210 mg/L的木犀草素混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按優(yōu)化的色譜條件進行檢測。兩組分分別以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量濃度(c，mg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表1。結(jié)果表明柚皮苷和木犀草素均具有良好的線性關(guān)系。

表1 兩種組分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍

2.5 精密度和重復(fù)性試驗

取混合對照品溶液(720 mg/L柚皮苷和105 mg/L木犀草素)，在優(yōu)化的色譜條件下連續(xù)進樣5次，測定柚皮苷和木犀草素峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果分別為1.06%和0.31%，精密度良好。準(zhǔn)確稱取同一種庫魯木提草樣品5份，每份約1.0 g，按優(yōu)化的提取方法制備庫魯木提草供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，計算庫魯木提草提取液中的柚皮苷和木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.64%和0.54%，實驗結(jié)果表明提取方法和測定重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性和回收率試驗

將同一種庫魯木提草樣品溶液，分別放置0、2、4、6、8、12、24 h后，按優(yōu)化的色譜分離條件進樣檢測。計算柚皮苷和木犀草素峰面積的RSD，結(jié)果分別為1.86%和0.73%，表明樣品提取溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

準(zhǔn)確稱取野生庫魯木提草樣品粉末9份，每份0.5 g，分別按低、中、高量精密加入柚皮苷和木犀草素的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每種加入量重復(fù)3次，按實驗部分制備加標(biāo)樣品溶液并在優(yōu)化的色譜條件檢測，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算回收率。結(jié)果表明柚皮苷和木犀草素回收率較穩(wěn)定，分別在93.8%～100.2%和98.3%～100.6%以內(nèi)，RSD分別在1.8%～2.7%和1.3%～2.9%，回收率結(jié)果如表2所示。

表2 庫魯木提草樣品的加標(biāo)回收率(n=3)

2.7 樣品測定

準(zhǔn)確吸取按實驗部分萃取方法制備的野生和人工栽培庫魯木提草供試品溶液10 μL進樣，按優(yōu)化的色譜條件分離測定，平行測定5次。記錄柚皮苷和木犀草素的峰面積并計算含量，分析結(jié)果見表3?？梢钥闯鲆吧鷰祠斈咎岵葜需制ぼ諡槿斯ぴ耘鄻悠泛康?.75倍，木犀草素含量是人工栽培樣品的2.97倍。兩種被測物含量結(jié)果表明野生庫魯木提草的品質(zhì)高于人工栽培庫魯木提草。

表3 樣品中柚皮苷和木犀草素的測定結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

本文建立了庫魯木提草中柚皮苷和木犀草素兩種活性成分的提取和檢測方法。選擇新疆南疆野生及人工栽培庫魯木提草，以80%甲醇水溶液為提取劑，通過浸泡、超聲處理實現(xiàn)高效提取。同時，優(yōu)化了柚皮苷和木犀草素的高效液相色譜檢測條件，兩種活性成分在40 min內(nèi)實現(xiàn)良好的基線分離。建立的分析方法簡便、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度較高，能夠同時用于庫魯木提草中柚皮苷和木犀草素含量的測定，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種活性成分在野生庫魯木提草中比在人工栽培庫魯木提草中的含量更高，說明野生庫魯木提草的藥用價值更高。本工作為庫魯木提草的質(zhì)量評價提供了可靠的依據(jù)，并為庫魯木提草資源的深度開發(fā)利用及藥用研究提供一定的數(shù)據(jù)支持。建立的方法對其他民族藥物分析和檢測具有一定的借鑒意義。

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