朱 俐, 馮 雪, 尹利輝*

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050;2.國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心，北京 10000)

降糖類保健食品擁有具大的市場，但為了追求功效在這類保健品中存在非法添加降糖類化學(xué)藥品，而患者長期服用這類保健食品容易出現(xiàn)心慌、昏迷、肝腎功能損傷等危害[1]，因此，快速準(zhǔn)確地辨別降糖類保健食品是否非法添加了西藥成分直接關(guān)系患者的安全。目前，傳統(tǒng)的分析檢測方法有液相色譜法[2]、毛細(xì)管電泳法[3]、核磁共振法[4]、流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光分子印記法[5]等。這些方法不僅需要復(fù)雜的前處理而且分析時(shí)間較長。離子遷移譜(Ion Mobility Spectrometry,IMS)是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一種新興的分離檢測技術(shù)，該技術(shù)是基于氣相中不同的氣相離子在電場中遷移速度的差異，對化學(xué)離子物質(zhì)進(jìn)行表征的一種分析方法。IMS法具有超快速、高靈敏的特點(diǎn)，并且儀器可開發(fā)為便攜式，特別適用于快速篩查。目前已有報(bào)道用IMS法對抗疲勞類保健食品[6]、改善睡眠類保健食品[7]、化妝品中的抗生素[8]，環(huán)境中揮發(fā)性有機(jī)物[9]等進(jìn)行檢測，而對降糖類保健食品中非法添加化學(xué)藥品的檢測尚未見報(bào)道。

本文采用IMS法，比較全面和系統(tǒng)的研究了檢測二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、格列吡嗪、格列齊特、鹽酸羅格列酮、鹽酸吡格列酮12種降糖藥品的IMS條件，以及該方法的穩(wěn)定性、精密度等，并將建立的方法應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測，獲得了良好的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Excellims GA2100電噴霧離子遷移譜儀，Vision Analysis軟件(版本2.2.2.10)；島津LC-20AD高效液相色譜儀；梅特勒XS105DU電子天平；Millipore A10超純水系統(tǒng)。

鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、格列吡嗪、格列齊特、鹽酸羅格列酮、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈、那格列萘標(biāo)準(zhǔn)品，均購自中國食品藥品檢定研究院。Fisher色譜級(jí)甲醇，其他試劑為色譜純。

保健食品樣品由天津市藥品檢驗(yàn)所、深圳市藥品檢驗(yàn)所、湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、安徽省食品藥品檢驗(yàn)所提供。

1.2 溶液制備

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取各標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，分別置于25 mL容量瓶中，用甲醇-水(80∶20，甲酸調(diào)節(jié)pH=2)溶解并定容，配制成200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液溶液，用時(shí)稀釋至合適濃度(1～10 μg·mL-1)作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2樣品溶液將樣品(若樣品為膠囊，則用內(nèi)容物)研磨混勻后，稱取50 mg，加入甲醇10 mL，超聲10 min，靜置后取其上清液過0.45 μm濾膜即為樣品提取液；再用甲醇-水(80∶20，甲酸調(diào)節(jié)pH=2)分別稀釋10、50、250倍，作為濃度梯度樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子遷移譜條件的選擇

本研究采用電噴霧離子遷移譜儀，其原理如圖1。樣品在去溶劑區(qū)離子化后，在電場的作用下，離子通過周期性開啟的離子門，在大氣壓下進(jìn)入弱電場漂移區(qū)，與逆流的中性漂移氣體分子不斷碰撞，由于這些離子在電場中各自遷移速率不同，使得不同的離子得到分離，先后到達(dá)檢測器被檢測，信號(hào)經(jīng)放大后以離子遷移譜圖形式輸出[6]。從IMS的原理可知，IMS檢測包含有兩個(gè)關(guān)鍵過程：一是氣相離子的形成；二是離子在遷移管中的遷移，氣相離子的生成決定了離子遷移譜檢測的第一步，只有形成足夠的氣相離子才可以被離子遷移譜儀檢測到。IMS的離子源電壓、遷移管電壓、遷移管溫度和遷移氣流量對氣相離子的形成和遷移均有較大影響，因此著重考察了這幾個(gè)條件對降糖藥品遷移時(shí)間和強(qiáng)度的影響。

圖1 離子遷移譜原理圖Fig.1 Schematic diagram of ion mobility spectrometry

圖2 離子源電壓強(qiáng)度的影響Fig.2 The influence of source voltage on intensity

圖3 遷移管溫度對遷移時(shí)間和強(qiáng)度的影響Fig.3 The influence of drift tube temperature on drift time and intensity

通過比較正源模式和負(fù)源模式，發(fā)現(xiàn)降糖藥物在正源模式下信號(hào)較好，因此選用正源模式進(jìn)行檢測。眾所周知，提高遷移管電壓，會(huì)減少遷移時(shí)間，提高離子強(qiáng)度，離子源電壓對遷移時(shí)間影響甚小，因此優(yōu)化IMS條件，研究了離子源電壓對降糖藥品離子強(qiáng)度的影響(圖2)，以及遷移管溫度對12種降糖藥品遷移時(shí)間和強(qiáng)度的影響(圖3)。通過研究可知，離子源電壓對離子強(qiáng)度有較大影響；而遷移管溫度對12種降糖藥品的遷移時(shí)間和強(qiáng)度均有較大影響，遷移管溫度越高，離子遷移時(shí)間越短，遷移管電壓越高，信號(hào)越強(qiáng)，而遷移管溫度高于220 ℃時(shí)，峰形有所展寬，導(dǎo)致信號(hào)降低。綜合考慮，選擇離子源電壓2.5 kV，遷移管電壓7 000 V，遷移管溫度180 ℃，該條件下各降糖類藥品峰形尖銳，靈敏度也較高。

2.2 溶劑的選擇

由于該儀器的靈敏度非常高，因此實(shí)際應(yīng)用中微量雜質(zhì)也有可能有信號(hào)，影響結(jié)果判斷。因此如果提高目標(biāo)物的靈敏度，提高其信號(hào)強(qiáng)度，可避免誤判。在研究過程中發(fā)現(xiàn)溶劑采用甲醇-水(80∶20,V/V)，并用甲酸調(diào)節(jié)到pH為2時(shí)，目標(biāo)物的信號(hào)顯著增強(qiáng)，其他雜質(zhì)信號(hào)并沒有明顯增強(qiáng)。分析原因可能是這幾種降糖藥物的結(jié)構(gòu)含有可接受質(zhì)子的基團(tuán)，酸性條件下比較容易形成[M+H]+離子峰，而采用甲醇-水(80∶20)可以使溶劑粘度下降、溶液表面能較低，導(dǎo)致溶劑迅速蒸發(fā)，更易達(dá)到庫侖分裂條件，產(chǎn)生更小的子霧滴，有利于霧化，使得待測物信號(hào)增強(qiáng)。

圖4 色氨酸校正考察Fig.4 The drift time measured after calibration by trptophan

2.3 離子遷移譜的校正

IMS分析中，離子遷移時(shí)間是定性的關(guān)鍵因素。由于儀器出廠時(shí)正源模式都采用校正物質(zhì)色氨酸進(jìn)行檢測，故采用色氨酸的遷移時(shí)間10.210 ms作為校正時(shí)間，將測試條件都校準(zhǔn)至出廠時(shí)的條件，得到出廠條件下各被測物的遷移時(shí)間，不僅可以實(shí)現(xiàn)ESI-IMS各儀器之間測得遷移時(shí)間的直接比較，而且還可以保證每次測試的各物質(zhì)的遷移時(shí)間的穩(wěn)定性。通過對校正物質(zhì)遷移時(shí)間的考察，我們發(fā)現(xiàn)在3 h以內(nèi)儀器校正穩(wěn)定性良好，偏差不超過0.005 ms。圖4是色氨酸遷移時(shí)間的考察曲線，從圖中可知為了確保校正的可靠性，建議儀器應(yīng)每2 h用色氨酸進(jìn)行一次校正。

2.4 遷移時(shí)間及檢出限

取12種降糖藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，樣品溶液濃度由低到高進(jìn)入IMS儀進(jìn)行分析，各濃度平行采集6次，并分別在4～8月份進(jìn)行試驗(yàn)，考察每種藥品的遷移時(shí)間范圍，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)條件下的約化遷移率(K0)，并建立12種降糖藥品的IMS數(shù)據(jù)庫。以信噪比(S/N)為3時(shí)的檢出濃度作為檢出限(LOD)，具體結(jié)果見表1。

表1 降糖類藥物對照品IMS特性

研究發(fā)現(xiàn)，雙胍類藥物的IMS響應(yīng)很強(qiáng)，靈敏度很高，檢測限可達(dá)ng·mL-1級(jí)，這與雙胍類藥物中含有堿性極強(qiáng)的胍基，易于質(zhì)子化有關(guān)，噻唑烷酮類藥物也是以鹽酸鹽形式存在，響應(yīng)也較好；磺酰脲類藥物測限較高，響應(yīng)較低，10 μg·mL-1格列本脲、格列吡嗪、格列喹酮響應(yīng)分別僅有約0.2、0.3、0.25 V，這與磺酰脲基團(tuán)里的N原子的孤對電子與磺?；纬晒曹楏w系，電子向雙鍵轉(zhuǎn)移，給電子趨勢減弱，進(jìn)而使得其加合質(zhì)子能力降低有關(guān)；而格列齊特結(jié)構(gòu)中磺酰脲基的N原子與一叔N原子連接，有利于其質(zhì)子化，響應(yīng)相比較格列本脲、格列吡嗪、格列喹酮有所增強(qiáng)。

2.5 穩(wěn)定性考察

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)是在4個(gè)月內(nèi)，每個(gè)月隨機(jī)選取5 d對各物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行IMS分析，每次每種標(biāo)準(zhǔn)溶液平行采集6針，觀察4個(gè)月內(nèi)遷移時(shí)間的穩(wěn)定性。12種降糖藥物在 4 個(gè)月內(nèi)任意5 d的遷移時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差均在0.05 ms以內(nèi)，且遷移時(shí)間的RSD均在 0.5% 以內(nèi)，穩(wěn)定性良好。說明以遷移時(shí)間為定性指標(biāo)建立非法添加物IMS標(biāo)準(zhǔn)譜庫的可行性。在實(shí)際樣品的分析中可直接利用該譜庫進(jìn)行非法添加物的初步篩查，檢測方便快速，而不必使用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對照，更加適用于現(xiàn)場快速篩查。

2.6 樣品分析

圖5 輔助降血糖類空白對照樣品IMS圖Fig.5 IMS of blank sample without hypoglycemic drugs

2.6.1樣品基質(zhì)干擾考察選取用液相色譜法未檢出降糖藥品的樣品來考察基質(zhì)干擾情況，離子遷移譜圖如圖5，發(fā)現(xiàn)在降糖藥物出峰的位置均無干擾峰出現(xiàn)。

2.6.2實(shí)際樣品測定遷移管有較強(qiáng)的記憶效應(yīng)，如果進(jìn)樣濃度很高，其記憶效應(yīng)很難清洗干凈。由于樣品中非法添加藥品的含量未知，因此把樣品稀釋不同倍數(shù)，從低濃度采集數(shù)據(jù)，這樣不僅減小記憶效應(yīng)，還能有效保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確。樣品10的典型IMS圖和液相色譜如圖6所示。通過對實(shí)際樣品分析，并將IMS法檢測結(jié)果與液相色譜法[10]檢測結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)IMS法對陰性樣品及陽性樣品的判別正確率為100%，結(jié)果見表2。

從12種降糖藥物的離子遷移時(shí)間來看，有些藥物的遷移時(shí)間非常接近并且波動(dòng)范圍有重疊現(xiàn)象，如圖7所示。這種現(xiàn)象給最終作為定性判斷帶來困擾。但根據(jù)我們檢測各種樣品的得到的結(jié)果表明，保健食品非法添加化學(xué)藥品一般都是單品種添加或者至多兩種藥品添加；在實(shí)際樣品在檢測時(shí)，如果在B、C位置有峰，即可判斷該樣品非法添加的了化學(xué)藥品，完全可以達(dá)到快速篩查的目的。

圖6 樣品10的IMS譜圖(a)和液相色譜圖(b)Fig.6 IMS spectrum(a) and liquid chromatogram(b) of sample 10

圖7 藥品遷移時(shí)間重疊情況下結(jié)果判斷示意圖(A、B、C、D、E、F、G表示檢出未知物)Fig.7 Diagram of judgment from overlap of drugs drift time(A,B,C,D,E,F,G refer to detected drugs)表2 16種降血糖類保健食品IMS檢測結(jié)果Table 2 Measured drift times and ion mobilities of extracts from 16 dietary supplements fordiabetes mellitus,and identification of adulterants

SampleNo.DilutionmultipleDrifttime/msK0/(cm2·V-1·s-1)Detecteddrug1250×10.0108±0.00211.4686±0.0003Phenforminhydrochloride50×10.0102±0.00191.4687±0.00032250×10.0047±0.00051.4696±0.0001Phenforminhydrochloride50×10.0074±0.00051.4692±0.00013250×10.0047±0.00081.4696±0.0001Phenforminhydrochloride50×10.0054±0.00171.4694±0.00034250×7.9603±0.00241.8470±0.0006Metforminhydrochloride50×7.8988±0.00221.8614±0.00055250×7.9613±0.00081.8467±0.0002Metforminhydrochloride10.0074±0.00121.4692±0.0002Phenforminhydrochloride50×7.9595±0.00101.8472±0.000210.0092±0.00141.4688±0.00026aNone7aNone8bNone9250×7.9633±0.00101.8463±0.0002Metforminhydrochloride10.0032±0.00061.4698±0.0001Phenforminhydrochloride50×7.9595±0.00221.8472±0.0005Rosiglitazone10.0048±0.00191.4696±0.000312.6966±0.00241.1580±0.000210250×10.0100±0.00131.4688±0.0002Phenforminhydrochloride50×10.0100±0.00181.4688±0.000311250×7.9552±0.00161.8481±0.0004Metforminhydrochloride13.0480±0.00411.1269±0.0004Pioglitazone50×8.0146±0.01971.8345±0.004513.0402±0.00531.1273±0.000512250×7.9633±0.00051.8463±0.0001Metforminhydrochloride10.0084±0.00051.4690±0.0001Phenforminhydrochloride50×7.9583±0.00081.8474±0.000210.0060±0.00191.4693±0.000313250×10.0083±0.00081.4690±0.0001Phenforminhydrochloride50×10.0090±0.00061.4689±0.000114aNone15250×12.7148±0.00131.1563±0.0001Pioglitazone50×12.7150±0.00151.1563±0.000116250×7.9687±0.00041.8450±0.0009Metforminhydrochloride50×7.9712±0.00131.8444±0.0003

Note:a.soft capsules;b.pill;the others are capsules.

3 結(jié)論

建立了12種降糖藥品遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫，我們在另一臺(tái)不同地點(diǎn)(東營)相同型號(hào)的儀器進(jìn)行12種降糖藥物的遷移時(shí)間驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果12種降糖藥物的遷移時(shí)間均在本方法的遷移時(shí)間范圍內(nèi)，因此建立12種降糖藥物IMS遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫，可以在不同儀器間實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫的共享。本方法操作簡單，不需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過所建立的數(shù)據(jù)庫比對即可進(jìn)行快速篩查，分析速度極快(1 min)，篩查準(zhǔn)確率高(100%)，因此可考慮建立其他類保健食品非法添加藥品IMS遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用于實(shí)際檢測，減低檢測成本，提高效率，保證保健食品的質(zhì)量安全。

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