王穎希，張慶霞，薛盧艷，李 程，杜 娟，霍振義，焦章平

（北京市公安司法鑒定中心，北京 100192）

案件接觸性檢材主要指人體與物體接觸所遺留的表皮脫落細(xì)胞（下文簡(jiǎn)稱(chēng)脫落細(xì)胞），故嫌疑人使用的工具、戴過(guò)的手套、遺留的指紋等都可能含有不同數(shù)量的脫落細(xì)胞。接觸性檢材的DNA含量微，降解程度高，目前公安DNA實(shí)驗(yàn)室主要以磁珠法提取，工作量大、耗時(shí)長(zhǎng)。但接觸性檢材數(shù)量卻日益增多，而對(duì)檢驗(yàn)時(shí)間的要求越來(lái)越迫切，故DNA檢驗(yàn)工作的壓力越來(lái)越大[1-3]。DNA提取是檢驗(yàn)的關(guān)鍵，獲得的DNA模板質(zhì)量直接影響著后續(xù)實(shí)驗(yàn)。自動(dòng)化工作站提取方式具有高通量批量處理功能，可有效提升檢材處理效率，降低勞動(dòng)強(qiáng)度[4]。但以往的自動(dòng)化提取方法對(duì)微量DNA的提取能力存在不足，能否適用于批量處理接觸性檢材還需進(jìn)一步改進(jìn)和驗(yàn)證[5,8]。本文以KingFisher磁珠純化儀結(jié)合超微量磁珠法提取試劑盒，建立了自動(dòng)、高通量提取接觸性檢材DNA的新方法。測(cè)試結(jié)果顯示該方法適用檢材范圍廣，樣品處理效率高，DNA有效檢出率達(dá)71.5%，效果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

標(biāo)準(zhǔn)品 2800 M（濃度：10 ng/μ L，promega公司）；自制指紋樣本，7人的食指、中指、無(wú)名指分別在載玻片上各按一枚指紋，力度適中，按壓時(shí)間5 s左右，共21枚指紋樣本。本實(shí)驗(yàn)室日常案件送檢的接觸性檢材（均為棉簽擦拭脫落細(xì)胞或脫落細(xì)胞粘取器粘取的脫落細(xì)胞，如窗框拭子、作案工具拭子、嫌疑人遺留現(xiàn)場(chǎng)物品的粘取物等），共計(jì)870份，檢材未做區(qū)分。KingFisher磁珠提取純化系統(tǒng)（低通量版及高通量版）（博坤生物公司）、ML-超微量磁珠法DNA提取試劑盒（博坤生物公司）、ProFlex? PCR系統(tǒng)（Thermo公司）、3500xL基因分析儀（ABI公司）、ID Plus擴(kuò)增試劑盒（ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取

不同起始量標(biāo)準(zhǔn)DNA的回收實(shí)驗(yàn)。取DNA標(biāo)準(zhǔn)品 2800M（10 ng/μ L）5μ L 加入到 495 μ L 高純水中，稀釋成0.1 ng/μ L的純DNA標(biāo)準(zhǔn)品；分別吸取1.0、1.5、2.0、2.5 μ L稀釋后樣本，使用ML-超微量磁珠法DNA提取試劑盒對(duì)其消化，進(jìn)行0.1、0.15、0.2、0.25 ng純DNA回收實(shí)驗(yàn)，洗脫體積為30 μ L，每個(gè)濃度平行進(jìn)行10次試驗(yàn)。將預(yù)處理后的消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到KingFisher磁珠提取純化系統(tǒng)（低通量版，24道）進(jìn)行自動(dòng)化DNA提取。

單枚指紋DNA提取實(shí)驗(yàn)。利用擦拭1號(hào)（博坤生物公司），按照干濕標(biāo)準(zhǔn)兩步法對(duì)載玻片上指紋樣本進(jìn)行擦拭后放入1.5 mL離心管中。按試劑說(shuō)明書(shū)使用ML-超微量磁珠法DNA提取試劑盒對(duì)其進(jìn)行消化。將消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到KingFisher磁珠提取純化系統(tǒng)（低通量版）進(jìn)行自動(dòng)化DNA提取。

案件接觸性檢材檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)。棉簽擦拭物檢材直接剪取棉頭表層并置于離心提籃內(nèi)；脫落細(xì)胞粘取器粘取物直接取整個(gè)膜片放入1.5 mL離心管管底。除KingFisher磁珠提取純化系統(tǒng)選用高通量版外，其余同“單枚指紋DNA提取實(shí)驗(yàn)”操作。

1.2.2 擴(kuò)增及電泳分析

提取DNA的溶液采用ID Plus擴(kuò)增試劑盒經(jīng)ProFlex? PCR系統(tǒng)，以10 μ L體系（模板均為1μ L）擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3500xL遺傳分析儀進(jìn)行檢測(cè)，GeneMarker軟件進(jìn)行STR分型（RFU＞50）。未檢出或檢出10個(gè)基因座以下視為非有效檢出，檢出10個(gè)及以上基因座則作有效檢出。

2 結(jié)果

2.1 不同起始量標(biāo)準(zhǔn)DNA回收實(shí)驗(yàn)

將各樣本STR分型圖譜與已知標(biāo)準(zhǔn)DNA分型進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示所有樣本均得到準(zhǔn)確分型（表1），但0.1 ng標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本有一個(gè)在D7S820基因座缺失一個(gè)位點(diǎn)，另一個(gè)其RFU峰值偏低，只有51。其他0.15、0.2、0.25 ng標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本均檢出完整STR分型。

表1 不同起始量標(biāo)準(zhǔn)DNA回收樣本檢測(cè)結(jié)果Table 1 Standard DNA recoveries from different initial quantities of DNA

2.2 單枚指紋樣本檢測(cè)結(jié)果

將樣本檢出分型與被取樣者的分型比對(duì)（表2），其中11個(gè)樣本檢出10個(gè)以上基因座的單一分型，且與被取樣者分型一致；雖有1個(gè)混合分型，但以被取樣者的分型為主要峰型。非有效DNA檢出率為42.8%；有效DNA檢出率為57.2%。

表 2 單枚指紋樣本檢測(cè)結(jié)果Table 2 Amount of exposed STR loci of the DNA extracted from single fingerprints

2.3 實(shí)際案件檢材檢測(cè)結(jié)果

870例實(shí)驗(yàn)檢材檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表 3 870例案件送檢脫落細(xì)胞類(lèi)檢材檢測(cè)結(jié)果Table 3 Statistics of detected STR loci of exfoliated cells from 870 contact samples collected in daily forensic casework

其中206個(gè)樣本檢出單一16基因座分型，22個(gè)樣本檢出單一13～15基因座分型，51個(gè)樣本檢出單一10～13基因座分型，343個(gè)樣本檢出混合16基因座分型；70個(gè)樣本檢出10基因座以下分型，178個(gè)樣本未檢出分型。未檢出或10基因座以下分型視為非有效DNA提取，占比為28.5%；故有效DNA檢出率為71.5%。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，接觸性檢材DNA含量普遍在0.1～1.5 ng之間[9]。對(duì)這類(lèi)微量疑難檢材DNA的提取，需對(duì)從提取試劑到所用儀器的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化[10]。本研究選用KingFisher磁珠提取純化系統(tǒng)結(jié)合博坤超微量磁珠法DNA提取試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，得到了較高的檢出率，原因可能如下：該試劑盒磁珠顆粒小，使其吸附DNA的面積更大，故可在磁珠表面富集更多的DNA，而其磁珠的超順磁性又保證了更好的懸浮性和分散性；加之所選用自動(dòng)化工作站采用磁棒插入磁套浸進(jìn)液體進(jìn)行吸附，磁套離開(kāi)磁棒后置于溶液進(jìn)行釋放，相比通過(guò)磁力架反應(yīng)的傳統(tǒng)磁珠法可以提高檢出率。另外，該系列儀器可根據(jù)檢材條件而改變洗脫體積，故更有利于從微量脫落細(xì)胞樣本中獲得更高濃度的模板DNA。

本研究首先對(duì)選用的自動(dòng)化提取系統(tǒng)進(jìn)行提取靈敏度的測(cè)試。選擇濃度可準(zhǔn)確量化的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本，結(jié)果顯示該自動(dòng)化系統(tǒng)可對(duì)含量低至0.1 ng的標(biāo)準(zhǔn)DNA成功回收，獲得的STR分型也相對(duì)完整，表明該自動(dòng)化系統(tǒng)具有較高的提取靈敏度。

指紋是案件現(xiàn)場(chǎng)典型的接觸性檢材，而其中脫落細(xì)胞含量卻普遍較少，故屬疑難類(lèi)接觸性檢材。利用本文所建方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室制備的單指紋樣本進(jìn)行提取，STR分析顯示有效DNA檢出率可達(dá)到57.2%，為目前指紋DNA檢驗(yàn)的較好結(jié)果。而且，由于整個(gè)提取過(guò)程全部自動(dòng)化處理，方法的重復(fù)性高，能為穩(wěn)定可靠的大批量處理接觸性檢材DNA提供保障。在實(shí)際樣本的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，所選取的均為實(shí)際案件現(xiàn)場(chǎng)經(jīng)采樣工具二次轉(zhuǎn)移的接觸性檢材。經(jīng)STR檢驗(yàn)分析，有效DNA檢出率達(dá)到71.5%，其中單一16基因座分型檢出率為23.7%。這一結(jié)果即便與手工精細(xì)操作相比也令人滿意，表明自動(dòng)化系統(tǒng)應(yīng)用于接觸性檢材批量提取純化是切實(shí)可行的。

KingFisher磁珠純化儀可應(yīng)用于日常案件檢驗(yàn)，其中高通量版可以同時(shí)處理96個(gè)樣本。磁珠顆粒小，富集效率高，洗脫體積靈活，均有利于從微量接觸檢材中獲得高濃度的模板DNA；又因其適用檢材類(lèi)型廣，能有效提高各類(lèi)檢材DNA的檢出率，因而可降低檢驗(yàn)成本。磁珠法整合自動(dòng)化工作站能有效控制人為因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，減少DNA損失，同時(shí)還可避免樣本間的交叉污染，結(jié)果的準(zhǔn)確性更有保障，實(shí)驗(yàn)時(shí)間更短，提取96個(gè)樣本僅需1 h 3 min。

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