牛 勇，李 洋，盧延旭

（1.公安部刑事偵查局， 北京 100741；2.公安部物證鑒定中心，北京100038；3.中國刑事警察學院，沈陽110854）

目前藥物濫用導致人體死亡的案件數(shù)量仍然居高不下，公安法醫(yī)在處理這類案件中不僅要在公共安全預警監(jiān)測方面發(fā)揮重要作用，也要在公共健康方面進行研究做出自己的努力以降低藥物濫用導致人體死亡案件的數(shù)量。在我國因藥物濫用直接導致死亡的案件中，海洛因仍是目前最常見的麻醉性藥品，大量研究已證明海洛因的長時間濫用能嚴重影響成癮者的生存率。作為阿片類藥物，海洛因能通過阿片類受體直接影響機體的免疫細胞，如降低T細胞的增殖，阻礙巨噬細胞的吞噬作用。

作為炎癥反應介質的白介素（interleukin，IL），在傳遞免疫信息，激活與調節(jié)免疫細胞，介導T、B細胞活化，增殖與分化及在炎癥反應中起重要作用。在靜脈注射海洛因濫用人群中，其血清中各IL水平，如IL-6、IL-8都受到不同程度的影響，這說明海洛因能通過影響ILs對機體免疫反應過程產(chǎn)生作用。白介素-1 (IL-1)屬于白介素的一種，是由活化的巨噬細胞所產(chǎn)生，能夠刺激參與免疫反應的細胞增殖、分化并提高其功能。對于海洛因能否活化巨噬細胞功能進而直接影響IL-1分泌的研究尚少。

本文采用體外培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細胞，檢測海洛因對巨噬細胞分泌IL-1的作用，證實海洛因能直接刺激巨噬細胞分泌IL-1，進一步驗證了海洛因能通過對免疫功能的不良影響導致成癮人群死亡率的上升。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J小鼠，雄雌兼用，體質量（20±2） g。

1.2 實驗藥物

10 mg/mL鹽酸海洛因（ddH2O配制，pH=5.6）；脂多糖，刀豆球蛋白A（Sigma-Aldrich，圣路易斯，美國）；10%胎牛血清- RPMI1640培養(yǎng)液（105 IU/L青霉素，100 mg/L鏈霉素，pH=7.2， Gibco，美國）。

1.3 實驗儀器

HH-CP型CO2細胞培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療設備）；55O型酶聯(lián)免疫檢測儀（Bio-Rad，加州，美國）。

1.4 腹腔巨噬細胞的分離和白細胞介素-1的誘生[1]

以10%胎牛血清- RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)制備小白鼠腹腔細胞懸液（2×109/L），并以1 mL/孔標準加入24孔培養(yǎng)板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2 h，獲得單層腹腔巨噬細胞。Hanks液洗3次，復孔加入5 mg/L LPS-RPMI 1640培養(yǎng)液1 mL或10μg/mL的鹽酸海洛因1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集上清供IL-1檢測。

1.5 小鼠胸腺細胞的制備[2]

正常麻醉后處死C57BL/6J小鼠，無菌條件下取胸腺置培養(yǎng)皿中，其內裝有尼龍紗網(wǎng)和Hanks液，用注射器針芯研磨成細胞懸液。將細胞懸液置離心管內3000 r/min離心15 min，棄上清，加入10%胎牛血清- RPMI1640培養(yǎng)液，輕柔吹打細胞團塊至單細胞并調整細胞數(shù)為1×1010/L。

1.6 IL-1活性的檢測[1]

采用小白鼠胸腺細胞增殖法檢測。首先，將上述腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清液以1∶90稀釋，各取50 μL加入96孔培養(yǎng)板，每孔另加入ConA（終濃度3 mg/L）的RPMI1640培養(yǎng)液50 μL和1×1010/L小鼠胸腺細胞懸液100 μL（終濃度5×109/L），使每孔終體積為200 μL。其次，將96孔培養(yǎng)板置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)42 h，然后每孔加入5 g/L的MTT 10μL，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。最后，取出各培養(yǎng)孔中的液體依次置入1 mL離心管，3000 r/min離心5 min，棄上清，加入含有0.04 mol/L異丙醇的鹽酸200 μL，重新依次置入原培養(yǎng)孔，震蕩1 min，用酶標儀在405 nm處讀A值，結果以±SD表示。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用SPSS 13.0軟件（IBM，加州，美國）對海洛因實驗組與對照組在λ=405 nm處的A值進行t檢驗。P＜0.05則認為有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

體外試驗結果表明，與對照組相比較，在腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清中加入鹽酸海洛因（終濃度0.05μg/mL）能使腹腔巨噬細胞分泌的IL-1活性增加（見圖 1）。

圖1 海洛因對腹腔巨噬細胞分泌IL-1的影響（*P＜0.05）Fig.1 The effect of heroin on the IL-1 activity secreted by peritoneal macrophages（* represents P＜0.05）

3 討論

通過本次體外細胞試驗，我們發(fā)現(xiàn)較低濃度的海洛因就能夠使小鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-1的活性增強，這提示在長期海洛因濫用致人死亡的機制中，海洛因能夠通過促進巨噬細胞分泌IL-1進而影響成癮者全身炎癥反應。已有研究證明長期藥物濫用者機體常表現(xiàn)出超出正常人的免疫炎癥反應[3]，這可能與阿片類藥物慢性成癮者體內免疫細胞，如淋巴細胞膜表面μ受體表達水平與信號通路的改變有關[4-5]。對通過靜脈注射使用的濫用藥物可卡因進行研究發(fā)現(xiàn)，長期注射可卡因能夠導致濫用者機體免疫應答及炎癥反應異常增強[6-8]，在我們的實驗中，同作為靜脈濫用類藥品海洛因也能夠提高體內IL-1的水平，與可卡因相關研究的結果一致。

IL-1是包括三個氨基酸序列高度同源的蛋白質，由巨噬細胞產(chǎn)生并有多方面生物學功能的細胞因子，在調節(jié)免疫應答和炎癥反應中有重要作用。作為體內一種重要的炎癥介質，它參與和誘導體內多種炎癥反應通路。在調節(jié)炎癥反應的同時，IL-1還能損傷內皮細胞，損害機體心血管系統(tǒng)。在海洛因導致成癮的過程中，IL-1作為介質參與了小鼠腦部海馬區(qū)、杏仁核的炎癥反應過程，并很可能通過炎癥反應進一步參與海洛因成癮、戒斷、復吸的過程[9]。有研究指出，對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，海洛因可抑制一氧化氮（NO）的產(chǎn)生，進而通過作用腦部IL-1而對海洛因成癮者的學習、記憶功能產(chǎn)生消極影響[10]，這些研究揭示IL-1或可作為重要遞質參與了海洛因成癮過程，因此研究海洛因對機體中IL-1的影響可為闡明海洛因成癮機制發(fā)揮重要作用。

因此，研究海洛因濫用對成癮者體內不同組織中IL-1的調節(jié)作用，不僅能夠提高慢性海洛因濫用人群的生存率，也能夠幫助成癮者擺脫藥物依賴。本實驗只進行了初步探索，證實了海洛因能刺激巨噬細胞分泌IL-1，并增強IL-1的活性，而海洛因對人體免疫系統(tǒng)的影響還需進一步系統(tǒng)性的研究。

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