康開彪，顏春魯，姚貞宇，辛 陽

1甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州730050；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)；3蘭州市第一人民醫(yī)院

鎘(Cadmium)是一種廣泛存在于自然界中的銀白色有光澤的重金屬，可以通過各種途徑進入機體，造成機體多器官、多系統(tǒng)損傷[1]。目前鎘中毒的研究主要集中在腎、肺、肝、辜丸、骨骼等器官及血液系統(tǒng)[2]，免疫系統(tǒng)相關(guān)研究較少。本實驗采用腹腔注射0.1%氯化鎘建立鎘染毒大鼠模型，通過觀察敦煌古醫(yī)方大補腎湯對染鎘大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量及肝組織白細胞介素2(IL-2)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)含量的影響，探討其在鎘導(dǎo)致氧化損傷和免疫毒性損傷方面的治療作用，為該藥防治鎘中毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(180±20)g，雌雄各半，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK(甘)2015-0002。

1.2 藥物 乙酰半胱氨酸泡騰片(富露施，注冊證號：H20090620，5.4 mg/mL)；大補腎湯水煎液(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科制備，地黃90g，竹葉 90 g，甘草 90 g，澤瀉 30 g，桂枝 30 g，干姜30g，五味子30g)制備好后置4℃冰箱保存，備用。

1.3 試劑 氯化鎘(天津市巴斯夫化工有限公司，批號：20081010)；考馬斯亮蘭試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20140309)；SOD活性和MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20140310和 20140305)；Rat IL-2 precocated ELISA kit和Rat TGF-β precocated ELISA kit檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號：20140509和 20140416)。

1.4 儀器 iMark型全自動酶標(biāo)分析儀(美國Bio-Rad公司)；FA2004N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；ZY12306型微量加樣器(ScienTiFic產(chǎn)品)；T6新悅-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；TDZ5-WS型醫(yī)用離心機(湖南平凡科技有限公司)。

1.5 動物分組、模型制備及給藥 大鼠60只適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，按照隨機數(shù)字表法分為6組：正常對照組、模型組、乙酰半胱氨酸組及大補腎湯低、中、高劑量組，每組10只。正常對照組腹腔注射0.9%NaCl，其余5組均腹腔注射0.1%氯化鎘，按1.5 mg/kg注射，每周5次，共5周。染毒的同時給予乙酰半胱氨酸泡騰片溶液(5.4 g/mL)及大補腎湯各劑量(高劑量：3.5g/mL，中劑量1.75 g/mL，低劑量0.875 g/mL)按照1 mL/100 g灌胃治療，1次/d，連續(xù)5周。最后1次注射24小時后，取大鼠肝臟及脾臟、胸腺組織待用。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 免疫器官指數(shù)的測定 末次給藥24小時后，稱量大鼠體質(zhì)量，眼球采血處死大鼠，摘取脾臟、胸腺等組織稱重，分別計算脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。脾臟(胸腺)指數(shù)=脾臟(胸腺)質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.6.2 肝組織SOD和MDA含量的測定 大鼠末次給藥24小時后，動脈采血處死大鼠，制備10%肝組織勻漿液，比色分析法測定肝組織中SOD活性及MDA含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.6.3 肝組織IL-2和TGF-β1含量的測定 肝組織勻漿液制備同“1.6.2”，ELISA法測定肝組織IL-2及TGF-β1的含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯化鎘染毒大鼠的一般情況及處死前體質(zhì)量變化情況 正常對照組大鼠進食、飲水、活動、大小便及呼吸狀態(tài)良好，皮毛有光澤、毛色光亮；鎘染毒組大鼠進食、飲水、活動均明顯減少，精神萎靡、抑郁，毛色暗淡、稀疏。大補腎湯各劑量組大鼠進食、飲水、活動較模型組改善，皮毛有光澤、毛色光亮，精神狀況良好。與正常對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量減輕(P＜0.05)；與模型組比較，各給藥干預(yù)組大鼠體質(zhì)量均增加，大補腎湯中、高劑量組作用較顯著(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠處死前體質(zhì)量變化情況(±s) g

表1 各組大鼠處死前體質(zhì)量變化情況(±s) g

注：#表示與正常對照組比較，P＜0.05；＊表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) 體質(zhì)量正常對照組 1 0 1 9 3.1 3±3 7.4 8模型組 1 0 1 4 4.4 0±1 1.5 5#乙酰半胱氨酸組 1 0 1 8 5.1 0±2 5.8 9＊大補腎湯高劑量組 1 0 1 8 5.1 4±2 2.9 3＊大補腎湯中劑量組 1 0 1 7 7.3 7±2 4.1 8＊大補腎湯低劑量組 1 0 1 7 2.5 0±1 2.0 5＊

2.2 大補腎湯對鎘染毒大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，各藥物干預(yù)組大鼠脾臟指數(shù)均增加，大補腎湯高劑量組胸腺指數(shù)增加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)比較(±s) mg/g

表2 各組大鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)比較(±s) mg/g

注：#表示與正常對照組比較，P＜0.05；＊表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) 脾臟指數(shù) 胸腺指數(shù)正常對照組 1 0 3.9 6±0.7 0 1.6 9±0.5 0模型組 1 0 1.8 6±0.4 3# 0.7 2±0.3 3#乙酰半胱氨酸組 1 0 2.8 0±0.6 1＊ 1.3 3±0.2 5＊大補腎湯高劑量組 1 0 2.5 0±0.6 8＊ 1.2 5±0.3 6＊大補腎湯中劑量組 1 0 2.2 1±0.3 4＊ 0.9 4±0.3 3＊大補腎湯低劑量組 1 0 2.1 8±0.3 3＊ 0.8 6±0.1 9＊

2.3 大補腎湯對鎘染毒大鼠肝組織SOD和MDA的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠SOD活力降低，MDA含量升高(P＜0.05)；與模型組比較，各給藥干預(yù)組大鼠SOD活力均增加，MDA含量均降低(P＜0.05)，見表 3。

表3 各組大鼠肝組織SOD活性及MDA含量比較(±s)

表3 各組大鼠肝組織SOD活性及MDA含量比較(±s)

注：#表示與正常對照組比較，P＜0.05；＊表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) S O D/(U·m L-1) M D A/(n m o l·m L-1)正常對照組 1 0 1 3 1.0 9±1 1.9 8 2.9 8±0.4 7模型組 1 0 7 9.3 6±1 0.7 1# 5.2 9±0.4 2#乙酰半胱氨酸組 1 0 1 2 3.3 9±1 4.4 0＊ 3.2 5±0.2 8＊大補腎湯高劑量組 1 0 1 1 3.2 1±1 4.2 2＊ 3.3 1±0.5 0＊大補腎湯中劑量組 1 0 1 1 4.2 2±1 4.8 9＊ 3.9 3±0.4 7＊大補腎湯低劑量組 1 0 1 0 9.9 5±1 1.6 4＊ 4.5 9±0.3 6＊

2.4 大補腎湯對鎘染毒大鼠肝組織細胞因子表達的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠IL-2含量降低，TGF-β1含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，各給藥干預(yù)組大鼠IL-2含量均增加，TGF-β1含量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

表4 各組大鼠肝組織IL-2和TGF-β1含量比較(±s)

表4 各組大鼠肝組織IL-2和TGF-β1含量比較(±s)

注：#表示與正常對照組比較，P＜0.05；＊表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) I L-2/(p g·m L-1)T G F-β 1/(n g·m L-1)正常對照組 1 0 1 7 0.8 3±1 0.2 1 5.1 1±0.5 9模型組 1 0 8 3.3 3±1 2.9 1#1 0.2 2±0.6 6#乙酰半胱氨酸組 1 0 1 5 1.3 9±1 4.3 5＊ 5.4 4±0.4 6＊大補腎湯高劑量組 1 0 1 4 8.8 1±1 4.7 7＊ 5.8 1±0.5 0＊大補腎湯中劑量組 1 0 1 4 0.1 8±1 3.6 9＊ 6.0 1±0.4 3＊大補腎湯低劑量組 1 0 1 3 4.7 1±1 2.2 7＊ 6.7 2±0.6 1＊

3 討論

“大補腎湯”出自敦煌古醫(yī)方，主要由地黃、竹葉、甘草、澤瀉、桂枝、干姜、五味子組成，主治精氣虛少，腰痛，骨萎，不可行走，虛熱沖逆，頭目眩，小便不利，脈軟而快者方。大量研究證實，地黃復(fù)方制劑“地黃益智顆?！盵3]、地黃有效成分“地黃多糖”[4-5]、竹葉提取物[6]、甘草有效成分“甘草苷”[7]和澤瀉[8]均可提高機體SOD活性，降低MDA含量，具有較好的抗氧化、提高免疫功能等生物學(xué)活性。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中SOD活性降低，MDA含量升高，可能是由于鎘與SOD中的二價金屬離子發(fā)生競爭性替代作用，抑制SOD活力有關(guān)[9]，也可能是鎘進入體內(nèi)產(chǎn)生的自由基不斷消耗SOD，導(dǎo)致模型組SOD活性降低，MDA含量升高。大補腎湯干預(yù)后各劑量組大鼠肝組織中的SOD活性升高，MDA含量降低，提示大補腎湯能夠增加氧自由基清除劑含量，抑制體內(nèi)脂質(zhì)過氧化過程，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量和氧自由基代謝產(chǎn)物的損害，調(diào)節(jié)氧化/抗氧化系統(tǒng)平衡，從而使機體細胞和組織免受鎘的損害。

胸腺與脾臟是機體重要的免疫器官，其結(jié)構(gòu)正常與否直接影響機體的免疫功能，胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)的高低變化可以反映機體的免疫功能狀態(tài)[10]。另外，IL-2 和 TGF-β1在免疫功能調(diào)節(jié)方面為一對截然相反的指標(biāo)。IL-2是機體正向免疫調(diào)節(jié)中最重要的細胞因子之一，主要由T淋巴細胞分泌，其功能是促進 T、B 淋巴細胞的增殖[11]。TGF-β1可能是免疫系統(tǒng)關(guān)閉的信號之一，其可以抑制所有淋巴細胞的增殖與功能[11]。本實驗結(jié)果表明，模型組大鼠胸、脾指數(shù)明顯降低，肝組織IL-2含量降低，TGF-β1含量升高，提示鎘染毒后，機體的免疫功能受損。大補腎湯干預(yù)后，各劑量組大鼠脾臟指數(shù)及IL-2含量增加，大補腎湯高劑量組大鼠胸腺指數(shù)增加，大補腎湯各劑量組大鼠TGF-β1含量降低。提示大補腎湯可能通過調(diào)節(jié)機體細胞因子表達，從而糾正和改善機體的免疫功能。

總之，鎘中毒可以導(dǎo)致機體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷及免疫功能紊亂。大補腎湯可能通過提高機體的抗氧化能力，加速機體自由基的清除來糾正機體的氧化和抗氧化之間的平衡失調(diào)，也可能通過調(diào)節(jié)細胞因子的表達來糾正和改善機體的免疫功能，最終達到拮抗鎘毒性的目的，從而對肝臟起到保護作用，但其具體機制尚需進一步研究。

[1]魏樹和，周啟星.重金屬污染土壤植物修復(fù)基本原理及強化措施探討[J].生態(tài)學(xué)雜志，2004，23(1)：65-72.

[2]Jomova K，Valko M.Advances in metal-induced oxidative stress and human disease[J].Toxicology，2011，283(2-3):65-87.

[3]劉志壽，楊小衛(wèi)，安紅梅，等.地黃益智顆粒防治D-半乳糖癡呆大鼠的作用機理研究[J].中藥藥理與臨床，2016，32(1)：124-127.

[4]彭輝.地黃多糖對心肌缺血再灌注損傷大鼠保護作用研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2016，18(6)：39-42.

[5]楊兵，夏先林，施曉麗，等.熟地黃多糖對斷奶仔豬抗氧化性能和免疫性能的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，28(4)：787-791.

[6]劉利江，熊正英，吳傳保.竹葉提取物對力竭訓(xùn)練大鼠臟器組織自由基代謝的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19(16)：268-271.

[7]孫國慶，羅正里.甘草苷對衰老模型大鼠的抗衰老作用[J].中國老年學(xué)雜志，2014，34(7)：1895-1896.

[8]張春舉，王丹，席蓓莉，等.澤瀉對ox-LDL致血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，24(4)：796-798.

[9]夏源，鄒志方，羅敏，等.原花青素對鎘染毒大鼠血清和肝臟中SOD活性、MDA含量的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2010，48(23)：8-10.

[10]趙迎虎，張明軍，劉進輝，等.中藥制劑對小鼠耐力及免疫器官指數(shù)影響[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2010，29(1)：14-17.

[11]費東亮，肖銀霞，蘇禹剛，等.鉛鎘聯(lián)合染毒對雞血液中細胞因子水平的影響[J].畜牧與獸醫(yī)，2012，44(8)：59-61.