李丹丹，王綏家，陳平亞，張體銀，楊俊興，劉忠梅，高慎陽

(1. 海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，?？?570311； 2. 福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，福州 350001； 3. 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，廣東深圳 518001； 4. 黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，哈爾濱 150001； 5. 遼寧醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院，遼寧錦州 121001)

猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus, SIV)是一種外源性逆轉錄病毒，對人具有潛在的感染性[1]。SIV感染繁殖猴群將直接影響其在生物醫(yī)學研究中的應用[2]。因此，實驗猴輸入國、出口國的檢疫要求都明確規(guī)定實驗猴SIV抗體必須為陰性[3]。目前，除了美國BioReliance和VRL等少數幾個實驗室擁有實驗猴SIV的ELISA試劑盒之外，市場上還沒有同類產品出售。國外試劑盒雖然準確率高，但價格昂貴，若進行大規(guī)模的SIV血清學調查，國內實驗猴養(yǎng)殖單位難以承受，因此往往只對即將出口的實驗猴購買少量國外試劑盒做一次性檢測。如果能夠建立一種快速、準確的實驗猴SIV抗體檢測方法，并研制出操作簡單、準確率高、價格低廉的試劑盒，將有助于國內開展實驗猴SIV的檢測工作。

免疫梳方法(immune comb, IC)是能夠對病毒血清抗體進行定性、定量檢測的一項新型體外診斷技術，這種技術突破性地將病毒抗原點布在具有極強蛋白吸附力的硝酸纖維膜上，把包被好的抗原膜貼附于PVC板以增加膜的強度和硬度，經機器裁切制成免疫梳。將此免疫梳插入稀釋好的待檢血清樣本時，特異性抗體與抗原結合并固著于膜上，再通過酶標二抗底物反應，染色后，抗體陽性的樣本表現為肉眼可見的紅色斑點，陰性則無顏色變化。膜經過圖像處理系統(tǒng)數據化后可以進行定量分析。該方法具有快速、簡便、經濟、不需任何特殊儀器，保留了常規(guī)ELISA的敏感、特異的優(yōu)點，又克服了許多繁瑣的操作，節(jié)省了操作時間，縮短了實驗周期，完全可在野外進行實地診斷檢測，達到快速診斷的目的，能夠滿足口岸機場、碼頭的快速通關檢測，在基層具有良好的運用推廣前景。本研究利用基因工程技術制備SIV的SIV30基因原核表達產物重組SIV30蛋白作為抗原診斷試劑，建立免疫梳方法用于對實驗猴血清中抗SIV的抗體IgG進行特異性檢測，為快速準確檢測SIV抗體提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌株及試劑

pMD18-T Vector、E.coliDH5α、感受態(tài)細胞(competent cell)和pGEX-4T-1購于寶生物工程有限公司；BL21(DE3)pLysS感受態(tài)表達菌購于天根生化科技(北京)有限公司；2×Taq MasterMix(含染料)、DL2000 DNA marker、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒購于康為世紀生物科技有限公司；IPTG、NC膜、顯色液為北京索萊寶科技有限公司產品；T4DNA Ligase、EcoR I、SmaI為NEB產品；猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴D型反轉錄病毒Ⅰ型(SRV1)、猴B病毒、猴T淋巴細胞趨向性病毒I型(STLV1)和猴麻疹病毒(MeV)陽性血清由海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心保存。

1.2 引物的設計與合成

根據已發(fā)表的國內外相關參考文獻進行初步理論篩選，之后登錄GenBank獲取SIV的參考序列(GenBank: M92714.1)在61aa-76aa處標識目標氨基酸序列SEGCTPYDINQMLNCV，編碼衣殼蛋白基因為TCAGAAGGCTGCACTCCCTATGACATCAATCA AATGCTAAATTGTGTA，在確定目標抗原表位序列位置大小之后，為提高目標抗原表位的合成效率利用OLIGO 7軟件設計重復串聯抗原表位基因序列，如下：GAATTCTCAGAAGGCTGCACTCCCTATGACAT CAATCAAATGCTAAATTGTGTATCAGAAGGCTGCAC TCCCTATGACATCAATCAAATGCTAAATTGTGTACT CGAG。利用交疊延伸PCR(SOE-PCR)的原理設計擴增SIV表位序列的SOE-PCR擴增引物[4-5]；引物序列如下：SIVF：GAATTCTCAGAAGGCTGCACTCC CTATGACATCAATCAAATGCTAAATTGTGTATCAGA;SIVR：CTCGAGTACACAATTTAGCATTTGATTGATG TCATAGGGAGTGCAGCCTTCTGATACAC.引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 SIV30蛋白的表達與鑒定

1.3.1 目的基因的擴增與重組表達質粒的構建

按照交疊延伸PCR原理進行1～2輪PCR核酸擴增以此獲得目標病毒表位基因序列[5-6]。用Sma I與EcoR I同時分別雙酶切含有SIV表位基因的克隆質粒pMD18T-SIV和表達載體pGEX-4T-1，膠回收酶切的目的片段。T4 DNA 連接酶連接回收后的PCR產物，16℃過夜，轉入表達菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細胞中，利用氨芐西林抗性篩選陽性菌落并提取質粒進行酶切鑒定，陽性菌體命名為pGEX-4T-SIV。

1.3.2 重組質粒的誘導表達及鑒定

將經測序鑒定后的陽性重組菌pGEX-4T-SIV/BL21(DE3)10 μL接種到5 mL含有25 μg的氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖菌培養(yǎng)至A600值為0.5～1.0時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG繼續(xù)同條件下誘導培養(yǎng)5 h，取1 mL 菌液，離心后進行SDS-PAGE蛋白電泳；取誘導表達后5 h的菌體，超聲破碎，SDS-PAGE電泳分析。

1.3.3 目的蛋白的純化和Westernblot鑒定

采用KCl染色切膠純化方法進行表達產物的純化。將誘導后的重組菌pGEX-4T-SIV/BL21(DE3)進行SDS-PAGE電泳檢測表達情況，然后用0.25 mol/L的KCl溶液染色膠片5 min；小心切下染成銀白色的目的條帶并用PBS洗3次，最后將膠條碾碎后置于EP管中，加PBS 500 μL振蕩混勻，-20℃反復凍溶3次，12 000 r/min離心2 min；取上清液即為純化的融合表達蛋白，采用BAC方法進行蛋白定量，調整深度后的蛋白溶液進行分裝，保存，備用，并進行Western blot鑒定[7]。

1.3.4 Western blot確定最佳抗原包被量

固定陽性血清濃度(1∶50)，將純化定量后的目的蛋白進行100-6梯度稀釋包被NC膜，然后進行western blot分析[7]，篩選最佳抗原包被量。即先將純化蛋白分別進行SDS-PAGE電泳，再并按常規(guī)方法進行蛋白轉印。WB鑒定時用SIV的陽性血清為一抗，室溫孵育1 h，再用兔抗猴IgG/HRP為二抗，室溫孵育1 h，最后用BICP/NBT進行底物顯色。

1.3.5 表達蛋白的Western blot特異性檢測

以上述抗原最佳包被量為標準，進行表達蛋白的特異性檢驗。選擇將SIV陽性血清做待檢一抗進行Western blot特異性檢測。

1.3.6 表達蛋白的Western blot敏感性檢測

將SIV陽性血清進行2倍倍比稀釋(1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800)分別進行Western blot敏感性檢驗，確定最大檢測稀釋度。

1.3.7 免疫梳檢測試紙的制備

根據上述試驗方法確定的抗原最佳包被濃度參數，將SIV抗原分別進行線性包被NC膜，將膜晾干。用5% BSA封閉液封閉NC膜過夜，棄去封閉液后再次晾干。將包被好的NC膜裁剪成10.5 mm×4 mm標準尺寸的試紙條，依次按4.5 mm間距整齊固定于150 mm×1 mm的PVC板上，12條為一組或直接裁剪包被好的NC膜制成IC，最終于自封袋中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.8 IC的使用方法與判定方法

將1∶25倍稀釋的待檢血清樣品轉移至96孔酶標反應板中，標記順序號。IC方法具體的操作步驟和判定方法參照張強等[7]的Western blot檢測方法進行。

1.3.9 IC檢測的特異性鑒定

按照優(yōu)化后的IC操作程序，分別對SIV、MeV、SRV1、BV和STLV1陽性血清1∶50倍稀釋用作特異性檢驗，判斷本方法的特異性。

1.3.10 IC檢測的敏感性試驗

將陽性對照和陰性對照血清進行1∶50倍稀釋各0.5 mL，再將SIV陽性血清分別從1∶25～1∶6400進行倍比稀釋，按照優(yōu)化后的IC操作程序進行檢測，確定該方法的靈敏度。

1.3.11 IC的重復性與穩(wěn)定性檢測

IC的重復性檢測：在同一批試驗中每份樣品平行作3次(批內)，在3個不同試驗日重復測定6份樣品(批間)。分別統(tǒng)計分析批內和批間重復試驗變異系數情況；IC的穩(wěn)定性檢測：將同一批次3條4℃保存，分別在1、3和6個月的間隔與新制備的IC同時對猴SIV的陰、陽性血清進行檢測，統(tǒng)計分析IC的特異性與敏感性沒有明顯變化，并再次對同一份樣品平行作3次進行比較分析其穩(wěn)定性。

1.3.12 IC實踐應用比較檢測評價

根據上述IC的使用描述方法和判定標準，將混有已知SIV的陽性血清與陰性血清分裝標記后，利用制備的IC與ELISA方法分別進行檢測比較，以此驗證其可靠性。

2 結果

2.1 SIV病毒抗原表位基因的PCR擴增結果

SIV30基因特異性引物經PCR 擴增后，得到了約96 bp 的目的片段, 與預計片段大小相符(圖1)。

注：1.水對照；2.擴增片段96 bp。圖1 擴增片段產物M: DNA marker 2000Note. M. DNA marker 2000. 1. Water control. 2. Amplified fragment 96 bp.Fig.1 Amplification of SIV30 gene fragment by PCR

2.2 SIV30基因測序結果

DNA 序列測定結果表明，所獲得序列長度為96 bp，與GenBank 上登錄的相應序列完全一致。

2.3 重組表達質粒pGEX-4T-SIV的鑒定

將表達質粒pGEX-4T-SIV經SmaI/EcoRI 雙酶切和電泳后，獲得的條帶大小符合預期，結合最終的測序結果進一步驗證，表明重組表達質粒構建正確，結果如圖2所示。

2.4 SIV表位抗原蛋白的SDS-PAGE分析結果

pGEX-4T-SIV融合蛋白經10% SDS-PAGE電泳分析，結果如圖3所示，目的病毒表位抗原獲得表達，大小范圍符合預期29 ku。

2.5 SIV表位抗原蛋白的純化結果

將SIV重組表位抗原表達產物進行切膠回收后再次進行SDS-PAGE電泳，分析純化回收情況，結果如圖4所示，SIV-30蛋白成功回收且純度均一。(圖4)

2.6 Western blot確定SIV抗原最佳包被量結果

將純化回收的重組SIV30蛋白濃度調整至2 mg/mL作為起始檢測量，依次進行100-5稀釋，分別進行Western blot分析檢測，結果表明最大檢測極限為103稀釋倍數的量濃度(2 μg/mL)。從肉眼可見度判定，以102稀釋倍數的量濃度(0.02 mg/mL)確定為最佳包被量。(圖5)

注：M.DNA Marker DS 5000 Ladder；1.經SmaI和Eco RⅠ雙酶切的pGEX-4T-SIV重組質粒；2.質粒pGEX-4T-SIV。圖2 pGEX-4T-SIV重組質粒的酶切鑒定Note. M. DNA marker DS 5000 ladder. 1. pGEX-4T-SIV plasmid was digested with restriction endonuclease SmaIand Eco R. 2. pGEX-4T-SIV plasmid.Fig.2 Restriction enzyme digestion map of the recombinant plasmid

注: M.蛋白marker；1～3. pGEX-4T空載體誘導表達菌；4.pGEX-4T-SIV誘導表達菌。圖3 表達產物的10% SDS-PAGE 電泳Note. M. Protein molecular standard.1-3. pGEX-4T induced expression product. 4. pGEX-4T-SIV induced expression．Fig.3 10% SDS-PAGE electrophoresis of expressed products

注：M.蛋白marker；1.純化后的pGEX-4T-SIV表達菌。圖4 融合蛋白純化后的10% SDS-PAGE 電泳Note: M. Protein marker. 1. Purified product of pGEX-4T-SIV.Fig.4 10% SDS-PAGE electrophoresis of purified products

注:1～6分別代表SIV30包被濃度,即，2 mg/mL、0.2 mg/mL、0.02 mg/mL、2 μg/mL、200 ng/mL、20 ng/mL和2 ng/mL。圖5 重組SIV30蛋白抗原最佳包被量確定Note. 1～6. Protein coating concentration, 2 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.02 mg/mL, 2 μg/mL, 200 ng/mL, 20 ng/mL and 2 ng/mL, respectively.Fig.5 Determination of the optimal coated amount of recombinant SIV30 protein

2.7 重組SIV30蛋白抗原特異性分析結果

將純化回收的重組SIV30蛋白以0.02 mg/mL量濃度的最佳包被量進行Western blot分析結果表明，重組SIV30能夠特異性地識別SIV陽性血清而不與其他猴病毒陽性血清發(fā)生交叉反應，說明SIV30抗原特異性良好。(圖6)

注:1-6.分別代表SIV30蛋白與SIV陽性血清，SRV1陽性血清，猴B病毒陽性血清，STLV1陽性血清和MeV陽性血清免疫反應的結果。圖6 重組SIV30蛋白抗原特異性Westernblot分析結果Note. 1～6. Results of immunoreactivity of SIV30 protein and SIV positive serum, SRV1 positive serum, BV positive serum, STLV1 positive serum, SIV negative serum, respectively.Fig.6 Antigen specificity of recombinant SIV30 protein analyzed by western blot

2.8 重組SIV30蛋白抗原敏感性分析結果

將純化回收的重組SIV30蛋白以0.02 mg/mL量濃度的最佳包被量進行Western blot敏感性分析結果表明，重組SIV30蛋白能夠敏感地檢測到1∶200稀釋的SIV陽性血清，由此說明重組SIV30蛋白抗原敏感性良好。(圖7)

2.9 制備的IC特異性檢驗結果

在根據上述Western blot分析確定的SIV抗原最佳包被量及其特異性與敏感性的分析基礎之上，將制備好的IC進行特異性評價。檢驗的結果如圖8所示，IC均能夠特異性檢測到相應的SIV陽性血清而不與其他病毒陽性血清間發(fā)生交叉反應，由此說明設計制備的IC特異性良好。

注:1～6.分別代表SIV30抗原與1:25/50/100/200/400/800倍稀釋的SIV陽性血清反應結果.圖7 Western blot分析重組SIV30蛋白抗原敏感性Note. 1-6. Results of immunoreactivity of SIV30 protein and 1∶25/50/100/200/400/800 times diluted SIV positive serum, respectively.Fig.7 Sensitivity of recombinant SIV30 protein analyzed by Western blot

注:“+/-”代表1∶50猴SIV陽性/陰性血清抗體對照，1代表1∶50抗猴SIV陽性血清；2-6分別代表抗猴1∶25的BV，SRV1，MeV，STLV陽性血清和SIV陰性血清參照，7-10分別代表1∶50的抗猴BV，SRV1，STLV1和MeV陽性血清參照。圖8 IC的特異性檢測結果Note.“+/-”. 1∶50 SIV positive/negative serum. 1. 1∶50 anti SIV positive serum. 2-6. 1∶25 anti BV/SRV1/ MeV /STLV1 positive serum and 1∶25 anti SIV negative serum. 7-10. 1∶50 anti BV,SRV1, STLV1 and MeV positive serum.Fig.8 Detection of the specificity of IC

2.10 制備的IC敏感性檢驗結果

在根據上述western blot分析確定的SIV抗原最佳包被量及其特異性與敏感性的分析基礎之上，對制備好的IC進行敏感性評價。檢驗的結果如圖9所示：SIV抗體IC的最大血清陽性檢測稀釋度為1∶400，由此說明設計制備的IC敏感性良好達到了預期。

注∶“+/-”代表1∶50猴SIV陽性/陰性血清抗體對照，1-9分別代表1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200以及1∶6400倍的抗SIV陽性血清，10代表空白對照。圖9 IC的敏感性檢測結果Note.“+/-”. 1∶50 SIV positive/negative serum. 1-9. 1∶25,1∶50, 1∶100, 1∶200, 1∶400, 1∶800, 1∶1600, 1∶3200 and 1∶6400 anti SIV positive serum. 10: Blank control.Fig.9 Detection of the sensitivity of IC

2.11 IC重復性和穩(wěn)定性

IC的重復性檢測：在同一批試驗中每份樣品平行作3次(批內)，在3個不同試驗日重復測定6份樣品(批間)。批內重復試驗變異系數(CV)為4.635 511%小于7%，批間重復試驗CV為5.563 486%小于10%，說明IC的重復性良好。IC的穩(wěn)定性檢測：將同一批次3條4℃保存，分別在1、3和6個月的間隔與新制備的IC同時對SIV的陰、陽性血清進行檢測。結果，IC的特異性與敏感性沒有明顯變化，對同一份樣品平行作3次進行比較，CV 為5.691 788%均小于10%，說明IC的穩(wěn)定性良好。

2.12 臨床測試比較結果

為了進一步檢驗制備的IC在實踐中檢測的可靠性，以商品化的ELISA試劑盒為參照對臨床采集的10份可疑猴血清樣品進行對比檢驗分析，結果表明，新建立的IC方法與ELISA方法同樣都檢測出1份陽性猴血清樣品和9份陰性猴血清樣品，檢測結果一致率為100.0%，Kappa=1.000，顯示出本研究建立的IC具有良好的實用性和可靠性。

3 討論

SIV主要破壞猴機體的免疫系統(tǒng)，獼猴感染SIV后期可能引發(fā)猴艾滋病(SAIDS)，SAIDS對獼猴具有很高的致死性，威脅猴群健康[8]。在猴群中進行血清抗體檢測，是防止病毒傳播流行的有效途徑[9]。目前，國內外用于SIV抗體的檢測，最常見的方法有ELISA、WB和IFA等[10]。ELISA方法靈敏度、特異性和準確性都較好，但是也存在一些局限：每次僅能檢測一種病毒抗體，如果需要同時檢測多種病毒抗體時，則檢測費用較為昂貴并且費時，完成檢測所需的樣本量較大，非常浪費，對于一些量少的樣本就比較困難。WB操作步驟繁瑣，反應性低并會出現非特異性條帶，從而在一定程度上也限制了其使用范圍。只有在驗證ELISA等實驗結果時才使用此法，顯然用于整個猴群的大規(guī)模監(jiān)測是不實際的。IFA是一種借助熒光顯微鏡檢查來觀察抗原-抗體特異性結合反應的檢測方法。由于免疫熒光法具有抗體特異性，且在熒光顯微鏡檢查之前只需較短時間的反應過程，因而它是一種快速篩選實驗猴病毒的方法。但免疫熒光檢測的結果不易判定，需經專門訓練的人員操作，所以在一定程度上限制了這種方法的使用范圍。

美國VRL公司現已研制出SIV抗體檢測試劑盒，準確率較高，但價格非常昂貴且僅限于實驗室使用，若對進出境的實驗猴進行大規(guī)模SIV抗體的血清學調查，國內實驗猴養(yǎng)殖單位難以承受。IC與傳統(tǒng)玻片法及ELISA相比，特異性抗原的使用克服了玻片法所用抗原質量問題所導致的假陽性和假陰性問題；染色結束后的IC結果直觀，肉眼即可觀察判斷，無需用酶聯免疫檢測儀測定A值，而且該IC可以長期保存以便后期復查。該方法具有快速、簡便、經濟、不需任何特殊儀器，保留了常規(guī)ELISA的敏感、特異的優(yōu)點，又克服了許多繁瑣的操作，節(jié)省了操作時間，縮短了實驗周期，完全可在野外進行實地診斷檢測，達到快速診斷的目的，能夠滿足口岸機場、碼頭的快速通關檢測，在基層具有良好的運用推廣前景。

近年來，基因工程重組技術和免疫標記技術的不斷發(fā)展、成熟，使多種動物源性病原及抗體的快速診斷試劑的研制與開發(fā)成為了可能[11]。因此，本研究根據自身已有的病毒結構蛋白的系統(tǒng)研究經驗，建立了以表位抗原為基礎的特異性針對SIV血清抗體檢測的IC，并進行了初步臨床比較應用研究。試驗結果表明IC具有準確、快速、簡便的優(yōu)點。與ELISA相比，二者臨床檢測結果符合率達100.0%，顯示出良好的實用性和可靠性。這為實驗猴SIV血清抗體檢測提供了一種可靠的檢測手段。

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